А. В. С.

Рис. 3.10. Электрофоретические картины радиоавтографов рестрикционных фрагментов реплицирующейся ДНК при двумерном электрофорезе в агарозном геле.

А. Репликация инициировалась за пределами изучаемого фрагмента ДНК, так что он содержит одну репликативную вилку. По мере её продвижения от правого конца фрагмента подвижность ДНК при электрофорезе во втором направлении уменьшается и достигает минимума, когда репликативная вилка находится в середине фрагмента. Поэтому дуга b Y-фрагмента состоит из восходящей и нисходящей ветвей. Диагональ нереплицированных нерадиоактивных фрагментов генома в целом представлена линией а.

В. Фрагмент содержит расположенную в его центре область начала двунаправленной репликации. По мере роста репликативного пузырька подвижность молекул ДНК монотонно уменьшается, и они образуют восходящую дугу с, расположенную выше дуги Y-фрагментов (изображена пунктиром).

С. Область начала двунаправленной расположена ближе к левому концу фрагмента. До тех пор, пока одна из репликативных вилок не достигнет этого конца, реплицирующийся фрагмент ведет себя как ДНК с пузырьком (ветвь с, как на рис. В). После этого фрагмент приобретает форму буквы Y (одна репликативная вилка) и попадает на нисходящую часть ветви b рис. А.

Жирная точка в правом нижнем углу соответствует радиоавтографу нереплицированных копий изучаемого фрагмента.

Альтернативные методы картирования предполагаемых ОНР у эукариотов основаны на выделении вновь реплицированных коротких фрагментов ДНК (~1 т.п.н.), которые синтезированы в синхронизированных в фазе S клетках за короткое время в присутствии специфических предшественников ДНК, например, 5-бромдезоксиуридина. Такие фрагменты можно очистить с использованием седиментации в градиенте плотности или антител, связывающих содержащую 5-бром-дУ ДНК. Количество вновь реплицированных фрагментов ДНК, синтезированных на определенном коротком сегменте генома, можно определить, используя конкурентную ПЦР-амплификацию с праймерами, специфичными для этого сегмента.

С применением этих методов удалоcь идентифицировать более 20 предполагаемых областей инициации двунаправленной репликации ДНК у дрожжей, лягушек и млекопитающих. Рассмотрим один из наиболее хорошо изученных локусов инициации – локус DHFR, расположенный между генами дигидрофолатредуктазы DHFR и 2В2121 в геноме клеток СНО яичника китайского хомячка. Метод двумерного электрофореза показал, что в этом локусе события инициации двунаправленной репликации распределены по очень широкой области длиной 56 т.п.н., названной зоной инициации. На первый взгляд, это свидетельствует об отсутствии строго определенных ОНР у млекопитающих. Однако с использованием анализа вновь синтезированной ДНК удалось добиться гораздо более хорошего разрешения первичных сайтов инициации в этой зоне. Оказалось, что локус DHFR содержит по меньшей мере 3 таких сайта (orib, b’ и g) не слишком большого размера (~2 т.п.н.) в пределах области длиной 28 т.п.н. (рис. 00, В).

Наиболее сильным сайтом инициации репликации является orib. Фрагмент хромосомной ДНК длиной 5, 8 т.п.н., содержащий orib, стабильно трансфицировали в другие (эктопические) положения генома клеток китайского хомячка, не имеющих эндогенного природного локуса DHFR. В нескольких альтернативных положениях сайт orib обеспечил такую же инициацию репликации хромосомной ДНК, как и в природном положении, т.е. этого сайта оказалось достаточно для не зависящей от положения в геноме инициации. Секвенирование показало, что в области orib содержатся богатые АТ области с остатками А в одной нити и остатками Т в другой, как в ARS из S. pombe. Кроме того, в этой области обнаружены два сайта связывания белка RIP, порождающего образование петли ДНК длиной 0, 7 т.п.н. и обладающего геликазной активностью, а также участок характеристически ихогнутой ДНК и повторы типа Alu.

Поскольку белки комплекса ORC дрожжей и млекопитающих имеют значительный уровень гомологии, естественно было ожидать, что в ОНР высших эукариотов содержатся сайты связывания ORC, похожие на элементы А и В1 последовательностей ARS дрожжей, ассоциация с которыми ORC является самым первым этапом в сборке комплексов инициации репликации. Выравнивание последовательностей ARS1 S. cerevisiae и 4 предполагаемых сайтов ori из хромосомной ДНК дрозофилы и млекопитающих показало, что и у высших эукариотов имеются богатые АТ участки ДНК, которые более чем на 50% идентичны элементам А и В1 из ARS1 (рис. 00). В локусе orib такой сайт гомологии с дрожжевым ОНР найден в единственном положении, близком к области первичной репликации ДНК. Этот сайт cовпадает с сайтом связывания компонента Orc2 комплекса ORC в локусе DHFR. Аналогичные сайты связывания ORC обнаружены также в локусах инициации репликации АСЕ3 у 4 видов дрозофилы и в ОНР гена b-глобина человека. Делеция 4 пар Г: Ц на расстоянии 3 п.н. с 3’-cтороны от участка orib, изображенного на рис. 00, понижает эффективность инициации репликации в 2 раза, так что возможный сайт связывания ORC является существенным. Эти данные позволяют предположить, что механизм селекции сайтов инициации репликации комплексом ORC является высококонсервативным среди всех эукариотов.

сайт связывания ORC

GAAA AG CAAG-CATA AAAGATC TAAACATAAA ATCTG ARS1 S. cerevisiae