Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

Контроль инициации репликации хромосомы в области oriC имеет два аспекта. Прежде всего, репликация инициируется в фиксированный момент клеточного цикла, через интервалы, равные времени удвоения клеточной массы. Время, требующееся для полной репликации генома, распределения дочерних хромосом и подготовки клетки к делению, в первом приближении не зависит от скорости роста клеток и составляет около 60 мин при 37^о. Если период генерации клеток меньше этого времени (например, в богатых средах), клетки инициируют репликацию хромосомы для следующей генерации ещё до завершения предыдущего раунда синтеза ДНК. Вследствие этого в быстро растущих культурах каждая клетка содержит 2ⁿ или 2ⁿ⁺¹ ОНР, где n – целое положительное число. Такое число ОНР обеспечивает распределение равного числа хромосом между двумя дочерними клетками при делении. Независимо от числа ОНР, репликация инициируется на всех ОНР в одной клетке одновременно. Механизмы, ответственные за сопряжение репликации бактериальных хромосом с клеточным циклом, пока изучены недостаточно. Предполагается, что инициация происходит при определенной клеточной массе, при которой cоздается критический “потенциал инициации”, т.е.достигается пороговая концентрация свободного белка DnaA в клетке или, скорее, его активной формы, т.е. комплекса с АТФ.

Второй аспект регуляции состоит в том, что каждая копия ОНР oriC в данной клетке используется для инициации репликации только один раз за клеточный цикл. Этот механизм контроля очень важен для жизнеспособности дочерних клеток и изучен более хорошо. Рассмотрим три пути, участвующих в такой регуляции.

Этот механизм определяется состоянием метилирования сайтов GATC в ОНР. В момент инициации репликации эти сайты в днДНК полностью метилированы, что способствует более эффективной инициации. В образовавшихся репликативных вилках вновь синтезированные нити ДНК включают неметилированные основания, так что в днДНК метилирована только родительская нить. В большинстве областей хромосомы метилирование de novo сайтов GATC под действием метилтрансферазы Dam происходит очень быстро (менее чем за 1 мин). Однако в области oriC метилирование сайтов GATC задержано на 13 мин, т.е. на треть клеточного цикла. На гемиметилированных сайтах GATC oriC инициация репликации нормально проходит в системах in vitro, но не идет in vivo. Это позволило предположить существование внутриклеточного фактора, являющегося негативным регулятором инициации и блокирующего (секвестрирующего) гемиметилированные ОНР в состоянии, недоступном как для быстрого метилирования под действием Dam, так и для быстрой реинициации репликации.

Таким фактором оказался белок SeqA длиной 181 остаток, несущественный для жизнеспособности клеток. В мутанте seqA метилирование вновь синтезированной ДНК oriC задержано не на 13 мин, а всего на 5 мин, в результате чего значительно нарушается синхронность репликации на множественных oriC. Белок SeqA преимущественно связывается с гемиметилированными, а не с полностью метилированными и неметилированными 13-мерами в oriC, в начале каждого из которых расположен сайт GATC. Из двух сайтов связывания SeqA в области 13-меров наиболее сильный расположен в 13-мере L. Белок SeqA связывается с этими гемиметилированными сайтами с большим сродством, чем метилаза Dam. К тому же SeqA имеет более высокую концентрацию в клетках, чем Dam, и не смещается с ДНК в присутствии Dam. Поэтому связывание SeqA с областью 13-меров защищает ДНК oriC от метилирования под действием Dam. Такое связывание приводит также к временной ассоциации области Dam c внешней мембраной клетки, поскольку белок SeqA может вести себя как мембранный белок. Связывание с мембраной не зависит от присутствия на ДНК oriC белка DnaА. Однако связывание SeqA с ДНК нестабильно, и через 10 мин связанный белок SeqA диссоциирует от ОНР oriC и делает её доступной для метилирования под действием метилазы Dam. Это приводит к восстановлению полностью метилированного состояния ДНК oriC, благоприятного для инициации.

Второй мишенью для секвестрирования при участии белка SeqA является промоторная область гена dnaA, кодирующего сам белок-иницатор. Она содержит не только блоки oriC, но и один сайт GATC, который после прохождения репликации также надолго задерживается в гемиметилированном состоянии из-за связывания с ним SeqA. Это вызывает временное ингибирование инициации транскрипции гена dnaA и препятствует увеличению концентрации белка DnaA в клетке. На том же уровне работают ещё два механизма предотращения несвоевременной инициации репликации в ОНР oriC.

Белок DnaA связывается с узнаваемыми им блоками DnaA не только в oriC и в гене dnaA, но и в ещё ~300 cайтах хромосомы E. coli. Эти сайты имеют имеют разное сродство к DnaA и конкурируют с oriC за связывание инициатора, понижая концентрацию свободного белка DnaA в клетке. Среди 5 областей хромосомы E. coli, имеющих наиболее высокое сродство к DnaA, особое положение занимает локус datA, расположенный на 95-ой мин хромосомы и реплицирующийся вскоре после инициации репликации на oriC. Этот локус длиной 950 п.н. содержит 4 блока DnaA, т.е. примерно столько же, как и ОНР oriC и соседний ген mioC, но может оттитровывать в 8 раз больше белка DnaA (300-400 молекул DnaA in vivo). Он неспособен секвестрироваться при участии SeqA, т.к. содержит очень мало сайтов GATC. Сразу после репликации локуса datA, которая происходит примерно в момент окончания секвестрирования oriC, количество связанного с ним белка DnaA удваивается, что приводит к значительному понижению внутриклеточного уровня свободного DnaA на следующем этапе клеточного цикла. Улавливание DnaA локусом datA существенно для регуляции инициации репликации хромосомы. Удаление datA из хромосомы вызывает избыточную инициацию, а повышение числа копий datA в клетке полностью выключает инициацию репликации на oriC. Однако перенос локуса datA в другие положения хромосомы не нарушает функцию datA, так что ранняя репликация datA несущественна для контроля инициации.

Сборка скользящих зажимов b-субъединиц ДНК-полимеразы III при инициации репликации на oriC запускает так называемый механизм RIDA регуляторной инактивации DnaA – гидролиз АТФ в активной форме DnaA-АТФ и переход белка-инициатора в неактивную форму DnaA-АДФ. Гидролиз АТФ ускоряется b-субъединицей PolIII и ещё одним недостаточно охарактеризованным белком IdaB. Этот механизм понижает “потенциал репликации”, как только был запущен раунд репликации хромосомы. Однако он недостаточен для предотвращения реинициации в отсутствие секвестрирования oriC и титрования локусом datA.

Период полураспада комплексов DnaA с АТФ или АДФ in vitro одинаков и составляет ~ 1 час. Однако если связанный с ДНК белок DnaA инкубировать в присутствии анионных фосфолипидов, ассоциированные с DnaA нуклеотиды освобождаются очень быстро, и DnaA, утративший связанный АДФ, приобретает способность связывать АТФ и возвращаться в активную форму DnaA-АТФ. Белок DnaA очень часто связывается с клеточной мембраной и взаимодействует в ней с анионными фосфолипидами. Это способствует накоплению комплекса DnaA-АТФ к моменту инициации следующего раунда репликации. Отсутствие в клетке анионных фосфолипидов вызывает неспособность инициировать репликацию хромосомы из oriC.

Таким образом, три разных механизма предотвращают преждевременную реинициацию и вносят вклад в запуск репликации в определенный момент клеточного цикла. Однако пока не доказано, что сочетания только этих механизмов достаточно для строгой регуляции инициации репликации хромосомы E. coli.

3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae