Инициация репликации у высших эукариотов

Гомологи большинства белков S. cerevisiae, участвующих в описанном выше пути инициации репликации (Orc1-Orc6, Cdc6, Mcm2-Мcm7, Cdc7-Dbf4 и Cdc45), сохраняются и у высших эукариотов (дрозофилы, лягушек Xenopus laevis и человека). В отличие от дрожжей, у которых в общем контроле клеточного цикла участвует одна киназа Cdc28, высшие эукаритоы на разных стадиях цикла используют разные циклин-зависимые протеинкиназы. Поэтому следует уточнить, что дрожжевые комплексы Cdc28-Clb5, 6 у высших эукариотов заменяются комплексами протеинкиназы Сdk2 с циклинами А и Е.

Особенно интересны свойства эукариотических белков Orc, которые, по аналогии с дрожжами, должны узнавать области начала репликации. Среди S. cerevisiae, дрозофилы и человека эти белки идентичны на 18-27% и гомологичны на 33-39% (табл. 4.1). Исключение составляет наименее консервативный белок Orc6, который у дрожжей не требуется для стабильного связывания ORC c ОНР. Максимальную гомологию проявляют белки Orc4. Более того, дрожжевому белку Orc4, участвующему во взаимодействии с последовательностью ACS, структурно гомологичны белок-инициатор репликации RepA плазмиды из бактерий Pseudomonas и белок Сdc6 из архея Pyrobaculum aerophilum. Это указывает на их консерватизм во всех 3 царствах жизни. Для 5 белков комплекса ORC (Orc1-Orc5) из многих эукариотов выполняется общее правило: их гомология на C-конце выше, чем на N-конце. С-концевые домены этих белков, вероятно, участвуют в гетероолигомеризации при образовании гексамерного комплекса ORC. Так, у человека С-конец Orc2 взаимодействует с Orc3, а С-конец Orc3 необходим для вовлечения в ORC субъединиц Orc4 и Orc5. N-концевые домены белков Orc, предположительно, требуются для взаимодействия с другими клеточными белками или с разными последовательностями ДНК.

Консерватизм основных участников последовательных стадий сборки инициирующих комплексов репликации согласуется и с экспериментальными данными, показавшими, что в общих чертах этапы пути инициации репликации у высших эукариотов такие же, как изображено на рис. 00 для S. cerevisiae. Однако имеются два существенных различия.

Если у почкующихся дрожжей комплекс ORC ведет себя как единое целое и остается связанным с ARS на протяжении всего клеточного цикла, то у млекопитающих этот комплекс разбирается по меньшей мере частично во время митоза и вновь собирается в самом начале фазы G₁. Так, белок Orc1 очень слабо ассоциирован с хроматином в митотических клетках млекопитающих и прочно связывается с ДНК в ранней фазе G₁ одновременно со сборкой преинициирующего комплекса. Такое временное освобождение Orc1 и, возможно, других компонентов ORC отсрочивает сборку предрепликативного комплекса до завершения митоза и восстановления ядерной структуры. Детали регуляции этого процесса сборки-разборки ORC были уточнены у Xenopus. В этой системе белки Orc освобождаются из хроматина при инкубации с экстрактом из метафазных клеток или с протеинкиназным комплексом Cdc2 – циклин А. Такое освобождение коррелирует с фосфорилированием субъединиц Orc1 и Orc2. Та же самая циклин-зависимая протеинкиназа ответственна и за продвижение клеток в фазу М. Одновременно она блокирует инициацию репликации до завершения фазы митоза, вызывая временную разборку комплекса ORC в конце каждого клеточного цикла.

Второй особенностью пути инициации репликации у высших эукариотов является участие наряду с Cdc6 дополнительного белка – фактора лицензирования репликации RLF-2 – в погрузке комплекса МСМ на ОRC, связанный с хроматином. В яйцах Xenopus RLF-2 также нужен для ассоциации белков Mcm с хроматином, хотя, скорее всего, его главная функция реализуется на более поздней стадии перехода от предрепликативного комплекса к комплексу активной репликации.

3.3.2. Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов