Искусственное снижение экспрессии генов

В разделе «Искусственная активация экспрессии генов» рассматривались подходы организации позитивной регуляции экспрессии целевых генов. В то же время в практике метаболической инженерии не редка ситуация, когда экспрессия гена важна для лучшей жизнеспособности клетки, но нежелательна в условиях целевого синтеза [ Nakashima и др., 2006 ]. В таких случаях хорошей альтернативой хромосомальным делециям являются подходы, осуществляющие подавление экспрессии гена (англ.: gene silencing). Идеальный способ подавления должен работать в триггерном режиме: либо абсолютно не влиять на природную экспрессию, либо эффективно ее подавлять. Способы, обеспечивающие эффективное подавление гена-мишени за счет добавления в среду специфического агента (например, PNA [ Nielsen и др., 1991 ]), в данном обзоре не рассматриваются, так как их использование усложняет и/или удорожает технологический процесс биосинтеза конечного продукта.

Большинство разработанных сегодня способов осуществляют регуляцию на транскрипционном или постранскрипционном уровне. Однако существует минимум один подход, действующий на белковом уровне [ McGinness и др., 2006 ]. Так как экспрессия гена заканчивается процессом формирования активной формы белка/РНК [ Патрушев, 2000 ], то de jure данный способ нельзя причислить к способам регуляции экспрессии. Однако, фактически способ обеспечивает эффективное изъятие из метаболической реакции соответствующего фермента, что схоже с подавлением экспрессии кодирующего его гена. Суть подхода заключается в регулируемой деградации целевого белка, меченного определенным образом. Авторами предлагается ввести в состав 5'-конца гена, кодирующего белок, последовательность длиной 45 нуклеотидов, кодирующей модифицированную SsrA последовательность. Известно что, наличие последовательности SsrA на C конце белка способствует его быстрой деградации [ Gottesman и др., 1998 ]. Также показано, что скорость деградации увеличивается в случае участия в процессе белка-адаптера SspB [ Levchenko и др., 2000 ]. Предлагаемая авторами подхода модификация природной последовательности SsrA приводит к абсолютной зависимости скорости деградации белка от присутствия адаптера SspB. Таким образом, индуцируя экспрессию белка SspB можно стимулировать процесс деградации белка, меченного модифицированной SsrA последовательностью. Очевидное преимущество подхода, возможность быстрой (в течение одного поколение клеток) деградации большого количества (в работе авторов > 10.000 копий) белка различной природы (крайне стабильные или входящие в состав комплексов) [ McGinness и др., 2006 ]. Также подход довольно универсален, что подтверждает ряд работ [ Grilly и др., 2007; Griffith и Grossman, 2008 ], так как для его реализации в другом организме достаточно иметь в нем ген sspB и два гена, кодирующих протазный комплекс. К его недостаткам можно отнести необходимость модификации С конца белка-мишени, и высокую энергетическую стоимость осуществления регуляции, так как синтез подвергающегося протеолизу белка не прекращается.

Более энергетически выгодно осуществлять негативную регуляцию на пост-транскрипционном уровне экспрессии. И сегодня абсолютное большинство подходов основываются на механизме РНК-РНК взаимодействий. Первая группа подходов основывается на механизме природной регуляции через взаимодействие антисмысловых РНК (асРНК) с целевой мРНК [ Brantl, 2002 ]. В природе в случае негативной регуляции целью асРНК являются либо 3' конец мРНК, взаимодействие с которым ускоряет деградацию мРНК, либо 5' конец, взаимодействие с которым блокирует инициацию трансляции. Следует упомянуть, что количество примеров искусственной регуляции посредством механизма РНК-РНК взаимодействия в прокариотах значительно уступает таковому в эукариотических системах. Большая часть регуляции в прокариотах осуществляется посредством блокирования инициации трансляции. В таком случае асРНК длиной 150-500 н. гомологичная к 5' области целевой мРНК, кодируется на плазмиде под контролем индуцибельного промотора [ Stefan и др., 2008; Boberek и др., 2010 ]. Индукция промотора обеспечивает подавление экспрессии гена-мишени, эффективность которой в различных работах широко варьируется, например эффективность подавления экспрессии гена lacZ в разных работах составляла 70-98% [ Stefan и др., 2008; Pestka и др., 1984 ]. Основная проблема обеспечения такого рода регуляции заключается в невозможности предсказать эффективность конкретной искусственной асРНК, по причине отсутствия на сегодняшний день точной модели РНК-РНК взаимодействия, а также в некоторой степени ограниченности наших предсказаний вторичной структы и стабильности РНК in vivo. И хотя существуют алгоритмы, разрешающие некоторые из описанных трудностей, как например увеличение стабильности за счет образования дуплекса между 5' и 3' концом асРНК [ Nakashima и др., 2006 ], исследователь зачастую вынужден экспериментальным образом подбирать структуру эффективной асРНК. Стоит отметить оригинальный подход, предложенный нашими соотечественниками. Он заключается в том, чтобы использовать последовательность асРНК параллельную целевой мРНК, а не антипараллельную как обычно используют [ Tchurikov и др., 2000 ]. Однако данный способ не получил на сегодня широкого распространения.

Другой способ обеспечения негативной регуляции на основе РНК-РНК взаимодействий основывается на функциональной роли РНКазы Р. Хорошо известно, что РНКаза Р участвует в процессинге тРНК, узнавая определенную вторичную структуру РНК молекулы [ Frank и Pace, 1998 ]. Создавая искусственно подобную вторичную структуру у гибрида мРНК с РНК специального дизайна, можно стимулировать расщипление мРНК и, следовательно, ее инактивацию [ Shen и др., 2009 ]. Данная стратегия получила название по названию ключевого элемента – искусственной РНК специального дизайна, EGS (англ.: e xternal g uide s equence). Однако ее эффективной реализации присущи те же сложности, что и описанным выше подходам, использующим асРНК.

Одна особенность подходов регуляции на основе РНК-РНК взаимодействии делает их неоптимальными для целей современной метаболической инженерии. Для высокой эффективности подавления необходима большая внутриклеточная концентрация регуляторной РНК (асРНК или EGS), следствием чего является необходимость значительной амплификации кодирующих ее генов, что достигается применением плазмидных систем экспрессии. Однако это, в свою очередь, противоречит основной тенденции метаболиической инженерии, созданию бесплазмидных штаммов-продуцентов. Для исследовательских же целей описанные подходы достаточно удобны, так как позволяют воздействовать на экспрессию генов даже тех организмов, для которых инструментарий модификации хромосомальной ДНК еще не сильно развит.

Еще более эффективно, с точки зрения энергетики клетки, негативный процесс регуляции можно обеспечить, воздействуя на транскрипционный уровень экспрессии гена-мишени. На сегодняшний день, однако, отработанных подходов осуществления такой регуляции нет, предложены только некоторые ее варианты. Например достаточно давно был показан эффект снижения уровня экспрессии гена, если тот был подвержен встречной транскрипции [ Ward и Murray, 1979; Elledge и Davis, 1989 ]. Явление получило название – транскрипционной интерференции [ Shearwin и др., 2005 ], но до сих пор оно остается слабоизученным, и публикации, демонстрирующие ее практическое применение, отсутствуют. Интересные перспективы также открываются с прогрессом в области синтетической биологии, а именно в связи с увеличением наших знаний регуляции транскрипции. Уже сейчас появляются работы, в которых транскриция с промотора искусственно негативно регулируется посредством белковых транскрипционных факторов через механизм образования ДНК-петли [ Zhao и др., 2010; Zhan и др., 2010 ]. Не вызывает сомнений, что в будущем прогресс знаний позволит глубоко модифицировать природный промотор, с добавлением в него элементов необходимой регуляции, в том числе и негативной. Однако, существенной трудностью в осуществлении регуляции на транскрипционном уровне может быть необходимость глубокой модификации ДНК в дистальной или промоторной области целевого гена. Невозможность предсказания последствий таких манипуляций и отсутствие необходимого генно-инженерного инструментария, возможно, являлись основными препятствующими факторами, и факторами, определившими большее развитие подходов, основыванных регуляторных элементах, на кодируемых in trans.

1.2. Бактериофаг Mu как инструментарий для генной инженерии.

Транспозоны – это мобильные генетические элементы, которые способствуют различным перестройкам генома, распространению среди популяции бактерий генов антибиотической устойчивости (Sherrat, D.J., 1995; Lamberg A. et al, 2002), а так же являются основным источником мутаций генома хозяина, включая инсерционные мутации, часто приводящие к инактивации генов. Транспозоны – незаменимый инструментарий в современной генетике. Типичное применение транспозонов – это использование их для картирования генов, для методик по секвенированию ДНК, для методов инсерционного мутагенеза и функционального генетического анализа. Бактериофаг Muсовмещает свойства умеренного фага и транспозона и является наиболее изученным транспозоном (Mizuuchi K., Craigie R., 1986).