Интегративные системы на основе бактериофага Ми.

Как уже упоминалось, способность бактериофага Muстимулировать образование делеций и инверсий в хромосоме хозяина широко применяется в генной инженерии (Van Gijsegen F. et al, 1987). Кроме того, на основе интегративной системы фага Mu разработаны методы интеграции различных генов, оперонов или генетических кассет в хромосому хозяина. Примером такой интегративной системы может служить система, состоящая из двух совместимых плазмид с относительно нестабильными репликонами, что в дальнейшем, после интеграции целевых генов в состав хромосомы, позволяет удалить эти плазмиды из клеток хозяина (Зименков Д.В. и др., 2004; Ахвердян В.З. и др., 2007). Первая из них - плазмида-помощник содержит в своем составе ген транспозазы и ген термочувствительного репрессора бактериофага Mu, что позволяет осуществлять термо-индуцибельный синтез фаговой транспозазы в бактериальной клетке. Вторая – интегративная плазмида содержит концевые фрагменты хромосомы фага Mu (Mu- attL. и Mu- attR), которые при активации транспозазы обеспечивают репликативную транспозицию расположенного между ними фрагмента ДНК и тем самым его возможную интеграцию в бактериальную хромосому.

В присутствии функционально активной транспозазы происходит репликативная транспозиция расположенной на интегративной плазмиде кассеты с целевыми генами, при этом перемещающаяся структура удваивается, и одна ее копия остается в исходном месте, то есть на плазмиде, а вторая оказывается в новом месте на хромосоме хозяина. Дальнейшее излечивание клеток от интегративной плазмиды приводит к утрате исходной кассеты с сохранением ее хромосомной копии. Однако при пролонгированном действии транспозазы уже интегрированная в хромосому кассета, претерпевая очередную репликативную транспозицию, может «ре-интегрировать» вторую копию в новый локус бактериального генома и т.д.

Несомненно, что такая система обладает рядом достоинств: высокая эффективность, возможность интеграции одной или одновременно нескольких копий кассет в различные локусы бактериальной хромосомы, возможность последовательной интеграции нескольких кассет. Но, не смотря на все преимущества, необходимо отметить очевидные недостатки такой интегративной системы. Во-первых, это предельно низкая специфичность Mu-интеграции, что делает невозможным заранее предсказать в какие локусы хромосомы произойдет встраивание кассет. Поэтому, как правило, первоначально кассеты интегрируют в хромосому промежуточного штамма, в котором определяют точки интеграции кассет и производят отбор подходящих для дальнейшей работы точек, интеграция в которые не вызывает изменений в экспрессии каких-либо существенных генов. После всех перечисленных процедур кассета с целевыми генами вводится в хромосому штамма-реципиента с помощью P1-зависимой трансдукции. Во-вторых, при интеграции каждой новой кассеты в хромосому с помощью Mu-системы происходит активация транспозазы. Поэтому возможна ретранспозиция уже имеющихся в штамме кассет, интегрированных с помощью этой системы. При этом очень тяжело проследить истинную причину возникновения новых свойств штамма. Несколько облегчает задачу использование интегративных кассет, содержащих селективный маркер. Наличие маркера позволяет последовательно совмещать различные кассеты из независимо полученных интегрантов с помощью P1-зависимой трансдукции в хромосоме одного реципиентного штамма.