Рекомбинационная инженерия

В конце прошлого начале нового тысячелетия появилась новая группа методов[ Zhang и др., 1998 ] направленной модификации ДНК. Генная инженерия на основе этих методов получила в англоязычной литературе общее название Recombineering (Recombi nation-mediated genetic engi neering) [ Ellis и др., 2001 ]. В русском языке используется термин «рекомбинационная инженерия», однако данный термин не является на данный момент устоявшимся. Рекомбинационная инженерия, как набор методов in vivo модификации ДНК, по сути, является развитием методов, основанных на механизме гомологичной рекомбинации, с учетом современных возможностей высокопроизводительного in vitro ДНК синтеза. Молекулярные биологи как следствие получили в распоряжение прецизионный инструмент быстрой in vivo модификации ДНК.

Гомологичная рекомбинация один из самых консервативных и жизненно необходимых механизмов, широко распространенных во всех живых существах. Являясь важным элементом системы репарации [ Kuzminov и др., 1999 ] и осуществляя обмен нуклеотидными последовательностями между молекулами ДНК (или частями одной молекулы), имеющими одинаковые или близкие нуклеотидные последовательности на достаточном протяжении своей длины, она обеспечивает безошибочное функционирование системы репликации ДНК [ Lusetti и Cox, 2002 ]. Исходя из молекулярных механизмов, лежащих в основе гомологичной рекомбинации, в клетке Escherichia coli ее условно можно разделить на две группы: RecA-зависимую или RecA-независимую. Как видно из названия, функционирование первой группы механизмов не возможно без участия специфического белка, RecA [ Cox и др., 1987 ]. Данный белок осуществляет центральные реакции гомологичной рекомбинации – поиск гомологии, образование синапсиса и миграцию ветвей [ Radding и др., 1982; Cox и др., 1987 ]. RecA образует спиральный филамент вокруг одцепочечной ДНК (оцДНК), находит участок двуцепочечной ДНК (дцДНК), гомологичный данной оцДНК, и катализирует реакцию обмена цепями ДНК между этими двумя молекулами.

В случае интеграции линейной ДНК в состав генома E. coli на концах дцДНК молекулы создаются однонитиевые участки, с которыми и связывается RecA. Такую подготовку субстрата для RecA могут осуществлять два различных набора клеточных белков, на основании которых уже RecA-зависимую рекомбинацию можно разделить на RecBCD и RecF-зависимую [ Smith и др., 1988 ]. Однако исследования процесса рекомбинации в мутантах по белкам различных групп выявили условность такого деления [ Amundsen и Smith, 2003 ].

Для эффективной RecA-зависимой рекомбинации требуются достаточно протяженные (несколько сотен нуклеотидов) участки гомологии [ Lovett и др., 2002 ]. До появления и широкого распространения высокопроизводительных методов in vitro синтеза ДНК данный факт не рассматривался как серьезный недостаток основанных на RecA-зависимой рекомбинации методов. Б о льшим недостатком считалась крайне низкая эффективность трансформации клеток E. coli дикого типа линейными дцДНК молекулами. В частности, это связано с деградацией привносимой ДНК внутриклеточными экзонуклеазами. С одной стороны, RecBCD (ExoV) является основным ферментом, ответственным за деградацию линейных двуцепочечных ДНК, не защищенных Chi-сайтами – октануклеотидами, имеющими последовательность 5'-GCTGGTGG-3' [ Zaman и Boles, 1996]. С другой стороны, хотя в мутантах recBC деградация ДНК идет не так эффективно, эти мутанты дефектны по рекомбинации, вследствие чего они имеют сниженную жизнеспособность [ Capaldo и Barbour, 1975; Russell и др., 1989 ]. Разные подходы были применены для повышения эффективности рекомбинации линейными фрагментами. Так в частности было показано, что штаммы, мутантные по генам recBC, могут быть трансформированы линейными ДНК, если они также несут супрессорные мутации, восстанавливающие рекомбинационную способность recBC мутантов. На пример, мутация sbcA инактивирует репрессор rac-профага, контролирующий экспрессию генов recET, что приводит к активации гена recE, кодирующего экзонуклеазу VIII (recE), которая по своему действию похожа на экзонуклеазу RecBCD. Однако RecE путь уже не является RecA-зависимым (см. ниже). Другой пример, супрессорные мутации в генах sbcB и sbcC, кодирующих экзонуклеазу ExoI, деградирующую оцДНК с 3'-конца, образующуюся при рекомбинации, и SbcCD, АТФ-зависимую экзонуклеазу, узнающую дцДНК [ Lloyd и Buckman, 1985 ]. Рекомбинация в таких мутантах идет по RecF-зависимому пути. Также из наблюдения, что мишенью для Chi-регуляции является RecD-субъединица ExoV, и в recD ^– мутантах RecBC постоянно проявляет ту же активность, что и RecBCD после взаимодействия с Chi [ Thaler и др., 1989 ], был сделан вывод, что штаммы E. coli recD ^– можно использовать в качестве реципиентов при проведении трансформации линейными молекулами ДНК. Позже был предложен метод, основанный на факте, что Chi-сайты, расположенные в нужной ориентации на ДНК, защищают линейную ДНК от деградации и стимулируют RecBCD-зависимую рекомбинацию. В работе Dabert и Smith [ Dabert and Smith, 1997 ] было показано, что присутствие двух правильно ориентированных Chi-сайтов на флангах интегрируемого линейного фрагмента позволяет повысить эффективность интеграции в клетках E. coli RecA⁺ RecBCD⁺ примерно в 50 раз. А еще два года спустя было показано [ El Karoui и др., 1999 ], что при электропорации компетентной культуры клеток E. coli происходит инактивация ExoV. В этой работе была проведена замена аллелей путем электропорации в клетки E. coli дикого типа линейных фрагментов ДНК. Выход интегрантов составил 10²-10³/мкг линейной ДНК при использовании плазмидной мишени и 60/мкг линейной ДНК, когда мишенью для интеграции служила хромосома. Однако последовательное повышение эффективности не исключало необходимости наличия протяженных гомологичных последовательностей на ДНК фрагменте, интеграция которого планировалась. Тем очевиднее тот факт, что с распространением техник in vitro ДНК синтеза и амплификации (ПЦР), использование протяженных участков гомологии превратилось в существенный недостаток RecA-зависимой гомологичной рекомбинации.

В свою очередь RecA-независимая гомологичная рекомбинация основывается на функциях белков RecE/RecT из rac-профага или Redα /Redβ (продукты генов оперона Red) из бактериофага λ [ Zhang и др., 1998; Muyrers и др., 1999; Murphy и др., 1998; Copeland и др., 2001; Court и др., 2002; Zhou и др., 2003 ]. Как было установлено фундаментальными исследованиями, пары RecE/RecT и Redα /Redβ функционально эквивалентны. RecE и Redα (Exo) – это высокопроцессивные 5'-3' экзонуклеазы, выполняющие функции комплекса RecBCD и RecQ из RecBCD и RecF путей RecA-зависимой рекомбинации, соответственно. В свою очередь RecT и Redβ (Bet) – ДНК связывающие белки, аналоги RecA, катализирующие отжиг оцДНК на ДНК-мишени [ Kolodner и др., 1994; Poteete, 2001 ]. В отличие от RecA-зависимых механизмов для эффективной рекомбинации данного типа не требуются протяженные участки гомологии. Так длина гомологичных участков для эффективной рекомбинации, в случае использования белков Redα /Redβ, составляет порядка 35-50 нуклеотидов [ Datsenko и Wanner, 2000; Yu и др., 2000 ]. Данный факт позволяет включать участки гомологии в состав нуклеотидной последовательности ПЦР праймеров, тем самым значительно ускоряя процесс получения интеграционных фрагментов ДНК, а, следовательно, и конечных модификаций. Также еще одной важной особенностью RecA-независимых систем является возможность интеграции фрагмента как дцДНК (обычно ПЦР продукт), так и синтетического одноцепочечного олигонуклеотида [ Sharan и др., 2009 ]. При этом эффективность рекомбинации олигонуклеотидом потенциально выше, чем эффективность рекомбинации дцДНК, которая в свою очередь выше эффективности, получаемой при использовании RecA-зависимых методов.

Хотя на данный момент, нет утвердившегося мнения по поводу молекулярного механизма RecA-независимой гомологичной рекомбинации. Однако на сегодняшний день ее наиболее вероятная модель, обеспечивающая большую долю эффекта, на примере Red системы фага λ, может состоять из следующих этапов [ Maresca и др., 2010 ]. На первом этапе белок Redα (Exo) фага λ полностью деградирует одну из цепей синтетической дцДНК в направлении 5'-3'. Концы полученной оцДНК защищаются от дальнейшей деградации посредством связывания с белком Redβ (Bet). Далее, фрагмент ДНК в комплексе с Bet белком в области репликации ДНК-мишени отжигается на отстающую цепь ДНК сначала 3', а потом и 5' концом (см. рис. 1.1). При такой модели в случае интеграции олигонуклеотида, необходимость в белке Exo полностью отсутствует. Так как модель не предполагает участие механизма внедрения оцДНК в ДНК дуплекс, она независима от активности белка RecA. Однако, есть экспериментальные свидетельства падения в 10-50 раз эффективности рекомбинации Red системой белков в мутантных recA штаммах [ Murphy, 1998; Yu и др., 2000 ], что, по-видимому, указывает на вовлеченность других механизмов рекомбинации в общий эффект интеграции. Еще один белок Red системы фага λ, Redγ (Gam), необходим в случае интеграции дцДНК, так как он блокирует активность мультифункционального комплекса RecBCD, тем самым препятствует деградации фрагмента [ Karu и др., 1975; Murphy, 1991 ].

Рисунок 1.1 (из Maresca и др., 2010). Модель Bet-зависимой рекомбинации в репликативную вилку. Изображен отжиг оцДНК в отстающую цепь репликативной вилки. оцДНК представлена двумя областями гомологии (~50 н.; желтые) окружающими гетерологичную последовательность (зеленый). Красные точки – Redβ белок. Ведущая цепь – синяя, отстающая – черная. DnaB хеликаза – светло оранжевая. Две ДНК полимеразы III – зеленые. (А) Отжиг 3' конца комплекса оцДНК с Redβ белком, играющий впоследствии роль праймера фрагмента Оказаки (В) отжиг 5' конца на вторую область гомологии и образование оцДНК гетеродуплекса.

Впервые Red-зависимая система рекомбинации была использована в работах Murphy [ Murphy, 1998, Murphy и др., 2000 ], который интегрировал линейный фрагмент ДНК, амплифицированный с помощью PCR, в хромосому клеток E. coli дикого типа. Необходимые для этого белки бактериофага λ Gam, Bet и Exo экспрессировались в составе мультикопийной плазмиды. Длина фланговых последовательностей, гомологичных месту интеграции, в составе использованного фрагмента ДНК, составляла порядка 1000 п.н. При этом достигнутая частота замещения гена при электропорации PCR-амплифицированного фрагмента ДНК в штамм дикого типа, содержащий указанную плазмиду, составила 3, 6× 10^-5 от числа выживших клеток. Что было на 1-2 порядка выше, чем при электропорации того же фрагмента методами, основанными на RecA-зависимой рекомбинации в штаммы E. coli recBC ^– sbcBC ^– или recD ^–.

Одновременно, Zhang [ Zhang и др., 1998 ] показал, что для RecET-зависимой системы рекомбинации длина гомологичных фланговых фрагментов может составлять только 40-60 п.н. Позднее в работе Yu [ Yu и др., 2000 ] было показано, что и при использовании Red-зависимой интеграции удается получать высокую частоту рекомбинации для линейных фрагментов ДНК, имеющих очень короткие относительно необходимых для RecA-зависимой рекомбинации (30-50 п.н.) области фланговой гомологии с местом интеграции. Последовательности такой длины могут быть введены в состав праймеров, используемых для PCR амплификации соответствующих фрагментов ДНК, что значительно упрощает проведение всей процедуры модификации.

Одновременно впервые была показана возможность in vivo модификации ДНК-мишени олигонуклеотидами [ Yu и др., 2000; Ellis и др., 2001 ]. При длине олигонуклеотидов в 70 н., из которой с обоих концов по 35 н. составляли последовательности комплементарные ДНК-мишени, достигаемые частоты рекомбинации были значительно выше, чем для случая интеграции дцДНК молекулы и находились в диапазоне от 1× 10^-4 до 6× 10^-2. Также впервые была продемонстрирована зависимость эффективности рекомбинации от того, какая из цепей ДНК-мишени является целью, ведущая или отстающая в процессе репликации хромосомы [ Ellis и др., 2001 ]. Позднее было также показано, что эффективность рекомбинации олигонуклеотида сильно зависит от активности MMR (m ethyl - directed m ismatch r epair) системы репарации [ Costantino и Court, 2003 ]. Учитывая все эти зависимости эффективности интеграции, а именно используя специальные реципиентные штаммы с нарушенной системой MMR и отстающую цепочку в качестве ДНК-мишени, для некоторых модификаций был получен 25% выход целевых рекомбинантов относительно всех выживших после электропорации клеток[ Costantino и Court, 2003 ]. Такая эффективность в перспективе делает ненужным использование маркера для последующего селективного отбора. Однако широкому практическому использованию штаммов дефектных по генам MMR системы на практике препятствует тот факт, что в таких штаммах увеличивается скорость накопления мутаций [ Modrich и Lahue, 1996 ], что само по себе крайне нежелательно. Хотя есть решения, обходящие данное затруднение: предварительное культивирование штамма реципиента в среде с ингибитором компонентов системы MMR (например: 2-аминопурин)[ Sawitzke и др., 2007 ]; учет в нуклеотидной последовательности оцДНК иерархии узнавания MMR ошибочно спаренных нуклеотидов [ Dohet и др., 1986; Su и др., 1988 ]; использование гетерологичной последовательности длиной больше той, которая эффективно распознается системой MMR [ Yang и Sharan, 2003 ].

В общем виде рекомбинационная инженерия, базируясь на методах RecA-независимой гомологичной рекомбинации и используя все ее преимущества, как-то прецизионность модификации, высокая эффективность рекомбинации и короткие участки фланговой гомологии, позволяет в оперативно и успешно решать широкий круг задач молекулярной биологии. Базовые протоколы хорошо разработаны, опробованы множество раз и описаны в соответствующих методических обзорах [ Sawitzke и др., 2007; Sharan и др., 2009 ]. Исследователю необходимо только выбрать оптимальный путь решения конкретной его задачи (см. рис. 1.2).

Рисунок 1.2 (из Sharan и др., 2009). Схема процедуры рекомбинации в зависимости от преследуемой цели

Несмотря на продемонстрированные в ряде работ высокие частоты рекомбинации, в большинстве случаев модификации ДНК необходимо использовать маркер, обеспечивающий последующую селекцию целевых рекомбинантов. Для некоторых задач современной молекулярной биологии отсутствует необходимость последующего удаление маркера из ДНК-мишени. Однако для большинства других, особенно в случае множественной модификации ДНК одного штамма, возможность удаления использованного маркера является необходимой опцией. Например, в метаболической инженерии, как прикладной области молекулярной биологии, основная цель которой оптимизация генетических и регуляторных процессов, приводящих к увеличению уровня биосинтеза интересующего продукта, условие возможности осуществления последовательности модификаций или объединения нескольких модификаций в одном штамме является обязательным. Ответом на эту необходимость было создание систем делеции, на основе механизма сайт-специфической рекомбинации.

Cайт-специфическими называют рекомбинации, при которых генетический обмен происходит только по участкам со строго определенной нуклеотидной последовательностью. Общая концепция рекомбинации между специфическими локусами была разработана в ходе исследований процессов интеграции и эксцизии фага λ [ Landy, 1989 ]. Участки рекомбинации, являющиеся партнерами в этом типе реакций, обязательно включают в себя сегменты (функциональные ядра) длиной 20-30 п.н., содержащие обычно по два сайта связывания рекомбиназы, образующих инвертированный повтор. Между сайтами связывания располагаются короткие асимметричные последовательности ДНК, одинаковые для двух рекомбинирующих участков. Асимметричность данных последовательностей позволяет говорить об определенной взаимной ориентации участков рекомбинации, которая в свою очередь определяет результат действия рекомбиназы. Кроме функционального ядра в состав участка рекомбинации могут входить дополнительные сайты связывания рекомбиназы, а также сайты связывания вспомогательных белков (например, FIS (f actor of i nversion s timulation), IHF (i ntegration h ost f actor)) (см. рис. 1.3).

Рисунок 1.3. Структура attP и attB сайтов фага λ. C, C’, B, B’ – сайты связывания белка Int в ядре; P1, P2, P1’, P2’, P3’ – плечевые сайты связывания белка Int; H1, H2, H’ – сайты связывания белка IHF; X1, X2 - сайты связывания белка Xis; F - сайт связывания белка Fis. участвуют в интеграции; участвуют в вырезании

Для осуществления сайт-специфической рекомбинации необходимо присутствие в геноме, по крайней мере, двух активных рекомбинационных сайтов и экспрессия в клетке-хозяине соответствующей рекомбиназы. Осуществляемая реакция обмена нитей ДНК не требует высокоэргических кофакторов (например, АТФ) и является полностью консервативной, то есть не сопровождается синтезом или деградацией ДНК [ Grindley и др., 2006 ]. В зависимости от расположения рекомбинационных сайтов, возможны три исхода сайт-специфической рекомбинации: интеграция, вырезание и инверсия [ Hallet и др, 1997 ] (см. рис. 1.4)

Рисунок 1.4. Возможный исход сайт-специфической рекомбинации

Интеграция является результатом рекомбинации между сайтами, расположенными на разных молекулах ДНК (при условии, что хотя бы одна из молекул ДНК является кольцевой) и происходит в определенной ориентации [ Landy, 1993; Nash, 1996 ]. Для сайтов же, расположенных на одной хромосоме, как уже упоминалось выше, результат сайт-специфической рекомбинации зависит от ориентации этих сайтов. Так вырезание является следствием рекомбинации между сайтами, ориентированными «голова к хвосту», то есть ориентированными в одном направлении, в то время как инверсия возникает при условии, что сайты направлены «голова к голове», то есть навстречу друг к другу. Соответственно, разработанные на основе сайт-специфической рекомбинации методы используются для интеграции, делеции и инверсии генетического материала.

Схема делеции селективного маркера после Red/ET-зависимой модификации ДНК-мишени предполагает на этапе синтеза структурной последовательности интегрируемого фрагмента ДНК фланкирование участка, содержащего маркер участками сайт-специфической рекомбинации в ориентации «голова к хвосту». Затем, отобрав рекомбинантный штамм в селективных условиях, в нем индуцируют экспрессию соответствующей рекомбиназы, удаляющей участок маркера из ДНК-мишени. Таким образом, следующие этапы модификации могут быть проведены с использованием того же самого антибиотического маркера. Для реализации описанной выше процедуры были созданы группы плазмид, кодирующие некоторые маркеры антибиотической устойчивости, фланкированные участками сайт-специфической рекомбинации, и гены соответствующих рекомбиназ. Как правило, использовались системы сайт-специфической рекомбинации – Cre- lox фага P1, дрожжевая система Flp- FRT, XerC/XerD и система на основе элементов бактериофага λ [ Dale и Ow, 1991; Cherepanov и Wackernagel, 1995; Bloor и Cranenburgh, 2006; Datsenko и Wanner, 2000; Каташкина и др., 2005 ]. Преимущество систем Cre- lox и Flp- FRT в том, что для их активности они не требуются какие-либо хозяйские факторы или Xis-подобные белки. Это выгодно отличает эти рекомбинационные системы от λ и λ -подобных систем, которые так же обеспечивают эффективное целевое изменение ДНК, но предполагают наличие специфических белков, что затрудняет их использование в других организмах. Однако, после использования Cre- lox и Flp- FRT рекомбинационных систем в хромосоме остается активный рекомбинационный сайт, способный участвовать в последующих актах рекомбинации. Это может привести к дополнительным хромосомным перестройкам при повторном использовании системы. Поэтому в случае, например Cre- lox системы для обеспечения возможности множественной модификации приходится использовать мутантные lox сайты, формирующие после акта рекомбинации неактивный мутантный сайт [ Albert и др., 1995 ]. Для работ на E. coli удобным является использование маркера, фланкированного сайтами attL и attR фага λ [ Peredelchuk и Bennett, 1997 ]. После Int/Xis зависимого вырезания маркера в хромосоме остается сайт attB, неактивный с точки зрения рекомбинации в отсутствие в клетке сайта attP. Это позволяет использовать этот же самый или аналогично устроенный маркер для последующих модификаций хромосомы.

Совмещение методов сайт-специфической рекомбинации с методами рекомбинационной инженерии раздвигает рамки диапазона решаемых задач, сохраняя при этом все описанные выше преимущества, как-то: быстрота, простота и прицизионность. Наглядный пример тому предложенный Datsenko и Wanner метод делеции гена с помощью Red-зависимой интеграции маркера, фланкированного FRT сайтами [ Datsenko и Wanner, 2000 ], дающий возможность быстро, просто и с прецизионной точностью инактивировать различные гены E. coli. Использование данного метода позволило получить библиотеку делеционных мутантов на основе штамма E. coli K-12 BW25113 (Keio коллекция) [ Baba и др., 2006 ]. Все делеции сконструированы таким образом, что после удаления селективного маркера оставшийся в хромосоме сайт FRT не нарушает трансляционную рамку считывания. Коллекция насчитывает 3985 дублированных делеций, из которых 1755 по генам с еще не изученными функциями. Другой пример, разработанная Минаевой стратегия сайт-специфической интеграции протяженных фрагментов в хромосому E. coli [ Minaeva и др., 2008 ]. Руководствуясь ею, с помощью Red-зависимой рекомбинации можно создать точку последующей интеграции протяженного фрагмента в любой желаемой позиции на хромосоме. Последующее удаление маркера совмещено с удалением плазмидной части интегративного вектора из хромосомы и позволяет многократно модифицировать один и тот же штамм. И примеров успешности такого совмещения методов можно привести множество.