Сайт-специфическая рекомбинация.

Сайт-специфическая рекомбинация – это рекомбинация двух молекул ДНК, происходящая только в особых местах (с низким уровнем гомологии или вовсе негомологичных), которая осуществляется с помощью определенного белка (рекомбиназы) и является консервативной, то есть не влечет синтеза или деградации ДНК, не происходит репликации ДНК, что отличает сайт-специфическую рекомбинацию от общей рекомбинации и транспозиции (Sadowski P.D., 1993; Gopaul D.N, van Duyne G.D., 1999; Grindley N.D.F. et al, 2006). Кроме того сайт-специфическая рекомбинация не требует высокоэнергетических кофакторов, таких как АТФ. Отличительной особенностью сайтов, участвующих в сайт-специфической рекомбинации является их полярность, т.е. отсутствие симметрии в первичной последовательности. Это определяет единственный механизм сайт-специфической рекомбинации. В зависимости от расположения рекомбинационных сайтов, возможны три исхода сайт-специфической рекомбинации: интеграция, вырезание и инверсия (Hallet B., Sherratt D.J., 1997) (Рисунок 1.6.)

Рисунок 1.6. События, возможные при сайт-специфической рекомбинации.

Интеграция является результатом рекомбинации между сайтами, расположенными на разных молекулах ДНК (при условии, что хотя бы одна из молекул ДНК является кольцевой) и происходит в определенной ориентации (Landy A., 1993; Nash H.A., 1996). Для сайтов, расположенных на одной хромосоме, результат сайт-специфической рекомбинации зависит от ориентации этих сайтов. Так вырезание является следствием рекомбинации между сайтами, ориентированными «голова к хвосту», то есть ориентированными в одном направлении, в то время как инверсия возникает при условии, что сайты направлены «голова к голове», то есть навстречу друг к другу. Соответственно, методы, разработанные на основе сайт-специфической рекомбинации, могут быть использованы для интеграции, делеции и инверсии генетического материала.

Процесс сайт-специфической рекомбинации может быть разделен на несколько этапов (Lee J., Jayaram M., 1993). Рекомбиназа связывается с двумя рекомбинационными сайтами. Оба рекомбинационных сайта взаимодействуют, образуя синаптический комплекс. После этого рекомбиназа катализирует разрыв, обмен цепями и сшивку ДНК внутри синаптического комплекса. В результате синаптический комплекс разрушается с образованием рекомбинантного продукта. Из описанного выше следует, что минимальные необходимые компоненты сайт-специфической рекомбинационной системы - это рекомбиназа и пара рекомбинационных сайтов. Простейший сайт – это короткий дуплексный участок ДНК 20-30 н.п. длиной (функциональное ядро), который содержит инвертированные пары распознаваемых рекомбиназой последовательностей и связывает одну димерную или две мономерные молекулы рекомбиназы. Такие сайты имеют в своем центре точку разрыва/сшивки ДНК. В природе, однако, встречается множество более сложных рекомбинационных сайтов, включающих не только функциональное ядро, но и дополнительные последовательности длиной до 100 и более нуклеотидных пар. Эти последовательности могут связывать большее количество копий рекомбиназы или других белковых факторов, ассоциированных с рекомбинационной системой и кодируемых клеткой-хозяином или генетическим элементом (фагом или транспозоном). Такой комплексный сайт может функционировать совместно с простым рекомбинационным сайтом. Примером может служить система рекомбинации фага λ, где хромосомный сайт attB состоит только из функционального ядра, а фаговый сайт attP кроме функционального ядра включает последовательности, в состав которых входят дополнительные сайты связывания рекомбиназы Int и хозяйского белка IHF. Добавочные сайты связывания рекомбиназы Int отличаются от сайтов связывания в функциональном ядре, за связывание с ними ответственны другие области рекомбиназы (Grindley N.D.F. et al, 2006).

Исследования показали, что дополнительные белковые факторы не обладают каталитической активностью, а могут выполнять структурные и регуляторные функции; инициировать или стабилизировать связывание рекомбинационных сайтов, или ингибировать несоответствующее спаривание; связывать каталитический домен рекомбиназы с рекомбинационным сайтом; могут определять направленность рекомбинации (например: способствовать делециям и предотвращать инверсии, и наоборот). Внесение разрывов и воссоединение нитей осуществляется только рекомбиназой. Разрыв и сшивка ДНК при сайт-специфической рекомбинации происходят без потерь или добавления нуклеотидов и с сохранением энергии фосфодиэфирных связей (Sadowski P.D., 1993). Надо заметить, что эти процессы отличаются для сериновых и тирозиновых рекомбиназ (Groth A.C., Calos M.P., 2004).