Студопедия

Главная страница Случайная страница

Разделы сайта

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Бактериофаг Mu и его производные.






Бактериофаг Mu умеренный фаг, способный инфицировать E.coli K12, так же как и других членов семейства Entrobacteriaceae, вызывая в них мутации. Он необычен среди транспозонов тем, что может использовать два способа транспозиции во время своего жизненного цикла – нерепликативную транспозицию (Liebart J.C. et al, 1982; Akroyd J., Symonds, 1983; Chaconas G. et al, 1983; Митькина Л.Н., 2003) и репликативную (Chaconas G. et al, 1981; Craig N.L., 1996). Независимо от выбора пути развития инъецированный фаговый геном интегрируется в хозяйскую хромосому по механизму консервативной транспозиции, приводящей к простому встраиванию одной копии фаговой ДНК. Во время литического развития транспозиция фага Mu происходит репликативным путем. Каждая новая копия является результатом транспозиции в новый сайт хозяйской ДНК, при этом появляется дополнительная копия фаговой ДНК в новом сайте встраивания и сохраняется копия в месте прежней локализации. Исторически были предложены различные модели для транспозиции фага Mu, но экспериментально подтверждение получила модель Shapiro (Shapiro J. A., 1979). Согласно этой модели, ДНК транспозона расщепляется на 3’-концах, которые затем переносятся на 5’-концы ДНК-мишени, образуя разветвления в местах соединения (интермедиат Shapiro) (Рисунок 1.4.).

 

Рисунок 1.4. Модель Shapiro для транспозиции.

 

Разрешение структуры «интермедиат Shapiro» может происходить либо путем деградации донорной ДНК и репарации образовавшихся разрывов, что приводит к простому встраиванию одной копии фаговой ДНК в хромосому хозяина (механизм консервативной транспозиции), либо путем инициации репликации на 3’-концах транспозона, в результате чего образуется коинтегрант, разрешение которого оканчивается встраиванием второй копии фаговой ДНК в новый сайт мишени при сохранении первой в прежнем месте хромосомы хозяина (для внутримолекулярной транспозиции) или в составе донорного репликона (в случае межмолекулярной транспозиции) (Arthur A., Sherratt D., 1979; Au T.K. et al, 2006).

Основную роль в обеспечении транспозиции фага Mu играет фаговый белок MuA (транспозаза А), находящийся в комплексетранспозосомы (Gueguen E. et al, 2005), где происходят сложные белок-нуклеиновые и белок-белковые взаимодействия (Chaconas G. et al, 1996; Naigamwalla D.Z., Chaconas G., 1997; Nakai H. et al, 2001). Транспозаза MuA последовательно ступенчато катализирует реакцию трансэтерификации на обоих концах транспозона. В настоящее время известно, что белок MuA участвует в специфическом узнавании концов фаговой ДНК, осуществляет образование однонитевых разрезов на концах Mu и в сайтах мишени, катализирует реакцию переноса нити, а также взаимодействует с белком MuB, (осуществляющим аллостерический контроль), и/или с хозяйским репликативным комплексом. На обоих концах фагового генома присутствуют по три связывающих транспозазу сайта, (содержащих подобные последовательности), L1 – L3 и R1 – R3. Многочисленность сайтов связывания транспозазы обусловлена сборкой высококооперативного нуклеопротеинового комплекса транспозосомы для реакции транспозиции. Способность связывать MuA неодинакова для шести сайтов, а также различна их значимость для транспозиции. Было показано, что тетрамер MuA взаимодействует преимущественно с тремя связывающими сайтами на концах фаговой ДНК: L1, R1 и R2 (Lavoie B.D. et al, 1991; Kuo C.et al, 1991; Mizuuchi M. et al, 1991; Lavoie B.D., Chaconas G., 1996;). Кроме того, для эффективной транспозиции фагового генома необходима определенная последовательность нуклеотидов или последовательность внутренней активации – IAS (internal activation sequences), которая является частью транспозиционного энхансера, вкючающего девять сайтов, связывающих транспозазу (Leung P.C. et al, 1989; Mizuuchi M, Mizuuchi K, 1989; Митькина Л.Н., 2003) (Рисунок 1.5.). IAS-элемент совпадает с операторами для c-репрессора (01 и 02), отвечающего за репрессию фагового генома в состоянии профага. Показано, что именно с ним временно связывается транспозаза MuA во время транспозиции (Harshey R.M. et al, 1985), поэтому возможно прямое ингибирование транспозиции благодаря конкуренции транспозазы с c–репрессором за IAS-элемент. Молекулы репрессора также взаимодействуют с концами фаговой ДНК, конкурируя с транспозазой (Craigie R. et al, 1984). Энхансер Mu прямо участвует в сборке структуры, которая содержит концы фаговой ДНК, связывая тетрамер транспозазы. Только внутри такого комплекса могут происходить реакции разрезания и соединения нитей. Был описан сложный круг взаимодействий между концами Mu и энхансером, включающий, по крайней мере пять сайтов, связывающих белок транспозазы на концах Mu, и девять сайтов на энхансоре (Lavoie B.D. et al, 1991; Mizuuchi K., 1992; Lavoie B.D., Chaconas G., 1996). Полагают, что транспозиционный энхансер Mu принимает изогнутую структуру, важную для функционирования. Возможно, что такой изгиб является следствием связывания с белком IHF или этому может способствовать взаимодействие с белком HU, когда уровни суперскрученности высоки и IHF не нужен (Surette M.G. et al, 1989; Surette M.G., Chaconas G., 1989; Kobryn K. et al, 1999;) (Рисунок 1.5.).

 

Рисунок 1.5. Области генома Mu, необходимые для транспозиции. A, B – гены, кодирующие белки транспозиции MuA и MuB; c и ner – гены репрессоров; L1, L2, L3, R1, R2, R3 – сайты связывания транспозазы MuA на левом attL -конце и правом attR -конце соответственно; 01, 02, 03 – операторные сайты, взаимодействующие с репрессором С; IAS (internal activation sequences) – внутренняя область активации; овалом обозначены сайты связывания бактериальных белков IHF (integration host factor) и HU.

Сложная архитектура ферментного комплекса с MuA обеспечивает катализ реакции транспозиции. Последнему этапу переноса и соединения разрезанных концов Mu с ДНК-мишенью способствуют АТФ и второй белок, участвующий в транспозиции, или активатор транспозиции – белок MuB. Белок MuB участвует в захвате мишени и определяет механизм иммунности мишени, предотвращая интеграцию фага в самого себя. Недавние результаты показали, что MuB увеличивает скорость и эффективность консервативной транспозиции, а такие функции белка как связывание с ДНК (Chaconas G. et al, 1985) и активация транспозазы (Maxwell A. et al, 1987; Adzuma K., Mizuuchi K., 1991), необходимы для эффективной репликативной транспозиции фага Mu (Roland L.A.S., Baker T.A., 2001). Зависимая от MuB регуляция транспозиции осуществляется благодаря выбору сайта мишени (Adzuma K., Mizuuchi K., 1988; Darzins A. et al, 1988) и защите правильно собранных транспозосом от преждевременной разборки (Levchenko I. et al, 1997).

Было показано, что транспозицию бактериофага Mu отличает предельно низкая специфичность (Wang X., Higgins P., 1994). Интеграция может происходить как в различные гены бактериальной хромосомы, так и в различные участки внутри одного гена, что в конечном итоге приводит к образованию различных мутаций, таких как инверсии, делеции, дупликации, транспозиции сегментов хозяйской ДНК. Это свойство оказалось полезным для генной инженерии, особенно для клонирования in vivo. Однако, следует заметить, что все описанные перестройки в хромосоме хозяина происходят только при литическом пути развития бактериофага Mu. Поэтому для того, чтобы использовать свойства фага Mu в генно-инженерных целях, необходимо было либо подобрать специфические условия роста, либо создать производные фага, способные вызывать все перечисленные модификации генома бактерий и при этом не вызывать гибель клеток.

Наиболее часто используемые производные бактериофага Mu – это мини-Mu элементы (Van Gijsegen F. et al, 1987; Groisman E.A., Casadaban M.J. 1987; Wang B. et al, 1987; Castilho B.A., Casadaban M.J., 1991; Haapa S. et al, 1999), у которых делетировано большинство генов, отвечающих за литический путь развития, и сохранены локусы, содержащие гены необходимые для транспозиции (интеграции – репликации) и упаковки фаговой ДНК в частицу. Надо отметить, что некоторые такие элементы могут не содержать в своем составе гена транспозазы MuAи белка-помошника MuB. Поэтому для транспозиции таких элементов оба этих гена должны располагаться в «помощнике», который обеспечивает их экспрессию. Эта система in trans достаточно удобна, так как после удаления «помощника» из клетки никакие перестройки генома хозяина не возможны.

Достаточно успешными в использовании для генной инженерии оказались производные фага Mu с дополнительными свойствами: термоиндуцибельностью (Mu c-ts62 – мутация в гене репрессора) и наличием селективного маркера.

 






© 2023 :: MyLektsii.ru :: Мои Лекции
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
Копирование текстов разрешено только с указанием индексируемой ссылки на источник.