Модификация структурной части гена

Метаболическая инженерия в силу своей практической направленности предъявляет некоторые специфические требования к методикам и процедурам модификации ДНК. Примером тому является модификация структурной части гена в хромосоме высокоэффективного штамма-продуцента. В рамках метаболической инженерии данная процедура, зачастую, состоит из собственно модификации целевого гена, но в хромосоме близкородственного штамма, и последующей трансдукции мутантного локуса в хромосому штамма-продуцента, для замены исходного целевого гена на модифицированный. Оба этапа сегодня могут быть значительно модернизированы методами рекомбинационной инженерии.

Впервые эффективный способ введения точечной мутации в конкретное положение был предложен в 1978 году [ Hutchison и др., 1978 ] за что руководитель группы был отмечен Нобелевской премией по химии в 1993 году. Метод получил название сайт-специфического мутагенеза (site-directed mutagenesis). Суть его состояла в in vitro гибридизации синтетического олигонуклеотида с подлежащим модификации участком, входящим в состав оцДНК, содержащей всю структуру целевого гена. Данный олигонуклеотид помимо последовательности гомологичной к матрице, содержал желаемые нуклеотидные замены. Впоследствии олигонуклеотид являлся праймером для in vitro достройки целевой ДНК. Таким образом, через введение в состав олигонуклеотида желаемая мутация оказывалась в составе целевой ДНК. В дальнейшем полученную мутантную ДНК, посредством клонирования в состав интегративного (суицидного или условно репликативного) вектора вводили в реципиентный организм [ Blomfield и др., 1991 ]. Появление техники ПЦР [ Saiki и др., 1985 ], немного изменило процедуру и упростило дальнейшее манипулирование с мутантной ДНК [ Kammann и др., 1989 ]. Однако все эти способы предполагали конструирование соответствующего интегративного вектора, что удлиняло время получения мутантного штамма.

Появившиеся методы рекомбинационной инженерии позволили осуществлять ту же стратегию, но in vivo, тем самым значительно сократив время проведение модификации. Впервые подобный подход был продемонстрирован в пионерской работе Yu и соавторов [ Yu и др., 2000 ]. В ней олигонуклеотид длиной 70 нуклеотидов, был полностью гомологичен кодирующей последовательности гена galK за исключением одного, расположенного в центре нуклеотида. Замещение данным нуклеотидом природного приводило к появлению Amber кодона (UAG вместо исходного UAU) в структурной части гена galK, и нарушало его экспрессию. Частота получения мутантов составляла 2× 10^-3. Однако необходимо заметить, что у авторов были условия селективного отбора (клетки с фенотипом galK ⁺ не могли расти на среде с 2-дезокси-галактозой [ Alper и Ames, 1975 ]), что значительно упрощало последующий отбор клонов с мутантным геном. В случае мутации, не приводящей к легко детектируемому фенотипу, обеспечивающем удобную селекцию, требуется использовать маркер, последовательность которого для завершения процесса конструирования мутации впоследствии необходимо полностью удалить. Реализация такого подхода двухстадийна, и подтверждение успешности завершения каждой стадии отслеживается посредством селекции и контр-селекции [ Reyrat и др., 1998 ]. На первом этапе, в район мутации интегрируется маркер(ы), фланкированные последовательностями гомологичными ближайшим нуклеотидам к будущей мутантной позиции. Затем рекомбинантные клоны по селективному маркеру изолируют. На втором этапе, интеграцией фрагмента, содержащего необходимую мутацию, фланкированную областями гомологии, удаляют маркер(ы) и отбирают по контр-селекции клоны с успешно интегрированной структурой.

Для селекции и контр-селекции обычно используются маркеры: пара cat-sacB [ Ellis и др., 2001 ], galK [ Warming и др., 2005 ], thyA [ Wong и др., 2005 ] и др. [ Reyrat и др., 1998 ]. Применение каждого из маркеров имеет свои преимущества и недостатки. Так пара cat-sacB не требует наличия фоновых делеций, но при этом кассета cat-sacB достаточно длинная (~3 т.п.н.), что представляет некоторые трудности при ее амплификации с помощью ПЦР. Также хорошо известно, что эффективность Red-зависимой интеграции снижается в зависимости от длины интегрируемого фрагмента [ Maresca и др., 2010 ]. Для других маркеров (например, galK, thyA) требуется наличие в реципиентном штамме соответствующих фоновых делеций. Общей сложностью использования контр-селекции также является появление якобы положительных исходов, вследствие спонтанного мутагенеза последовательности контр-селективного маркера, частота которой сравнима и иногда даже превышает частоту интеграции (частота мутирования гена sacB ~ 10^-4). Поэтому, использование на втором этапе (замена маркера(ов) на мутацию) в качестве интегрируемой ДНК олигонуклеотидов кажется более перспективным, однако как уже было показано эффективность рекомбинации олигонуклеотидами хотя потенциально и выше, чем фрагментом дцДНК, в свою очередь сильно зависти от активности MMR системы [ Murphy и Marinus, 2010 ].

Оригинальный метод осуществления in vivo сайт-специфического мутагенеза был предложен авторами Yang и Sharan [ Yang и Sharan, 2003 ]. Метод, получивший название «Hit& Fix», на первом этапе предполагает введение вместо селективной/контр-селективной кассеты денатурированных ПЦР продуктов небольшого размера (180 н. в работе авторов метода). ПЦР продукт содержит участок относительно протяженной гетерологичной последовательности (20 н.), включающей необходимый мутантный нуклеотид и фланкированной гомологичными к месту интеграции последовательностями (80 н.). Гетерологичная последовательность такой длины распознается системой MMR с низкой эффективностью [ Murphy и Marinus, 2010 ] и, в то же время, достаточна для достоверного скрининга методом на основе специфической процедуры ПЦР, получившей в англоязычной литературе название MAMA-PCR (от m ismatch a mplification m utation a ssay) [ Cha и др., 1992 ]. Метод основывается на зависимости эффективности ПЦР амплификации от степени гомологичности 3' конца праймера к матрице. Однако известно, что при небольшой гетерологии праймера к матричной последовательности вероятность его неспецифического отжига сохраняется, а, следовательно, сохраняется вероятность получить ложный сигнал. Поэтому увеличение гетерологии 3' конца праймера способствует точности метода скрининга на основе MAMA-PCR [ Morita и др., 2008 ], хотя при этом процедура приближается к стандартной ПЦР. На втором этапе в целевой участок интегрируется денатурированный ПЦР продукт, заменяющий гетерологочиную последовательность на исходную, за исключением одного или нескольких мутантных нуклеотидов (см. рис. 1.5), завершая тем самым процесс мутагенеза.

Рисунок 1.5. (из Yang и Sharan, 2003) «Hit& Fix» метод мутагенеза в Бактериальной искусственной хромосоме (англ.: BAC)

Таким образом, сегодня благодаря методам рекомбинационной инженерии можно осуществлять эффективный сайт-специфический мутагенез интересующего гена in situ. Однако как уже отмечалось выше, для целей метаболической инженерии необходимо еще обеспечить возможность простого скрининга мутации, после ее трансдукции в хромосому другого штамма.

Зачастую получаемые мутации не сопряжены с легко определяемым изменением фенотипа. Поэтому в арсенале классической генетики есть несколько методов, позволяющих проводить селекцию клеток несущих, интересующую мутацию. Однако реализация некоторых из них в практике метаболической инженерии предсталяет некоторые сложности. Так метод комплементации, суть которого состоит в восстановлении определенного признака при введении исследуемого гена, требует как инактивации соответствующего гена в хромосоме реципиентного штамма, так и специфических условий его селекции [ Stent, 1971 ]. Использование метода маркирования генами антибиотической устойчивости входящими в состав транспозонов [ Singer и др., 1989 ], предполагает значительные трудности на этапе обязательного удаления антибиотического маркера из хромосомы штамма-продуцента после трансдукции целевого фрагмента. Описанные же методы рекомбинационной инженерии на своей прецизионной основе вместе с методами сайт-специфической интеграции предоставляют широкие возможности осуществления маркирования генами устойчивости к антибиотикам, обеспечивающими удобную селекцию, которые впоследствии также могут быть легко удалены.