Перетворення білків у кишково-шлунковому тракті. Протеолітичні ферменти та їх специфічність.

Гідроліз, або перетворення екзогенних і ендогенних білків у живому організмі та клітинах, відбувається за участю протеолітичних ферментів - пептидгідролаз, протеїназ в екзергонічних реакціях. При цьому вільна енергія пептидних зв'язків (ентальпія) переходить у тепло.

Ферменти – ендопептидази діють на центральні ділянки поліпепдитного ланцюга: розщеплюють молекулу білка на дрібніші фрагменти. Друга група пептидгідролаз - екзопептидази - викликають гідроліз білків із С- чи N-кінців пептидного ланцюга і відщеплюють кінцеві амінокислоти.

Перетворення білків в організмі людини та тварин починається у шлунку. Протеолітичні ферменти шлунково-кишкового соку виробляються клітинами слизової оболонки шлунка, тонкого відділу кишечнику та підшлункової залози в неактивній формі - проферменти, які перетворюються на відповідні активні форми в харчовому каналі.

У шлунку протеїнази шлункового соку діють на змінені харчові білки, молекули яких денатурували під дією соляної кислоти, в результаті чого збільшилася поверхня та доступність зв'язків, що гідролізуються. Шлунковий сік виділяється залозами, локалізованими у слизовій оболонці шлунка: фундальними (дно шлунка), пілоричними (вихідна частина) та кардіальними.

Парієтальні клітини дна шлунка секретують соляну кислоту; секрет додаткових клітин містить переважно мукоїди, а головні клітини продукують неактивну форму пепсину - пепсиноген. Найважливішими протеолітичними ферментами шлункового соку є пепсин і хімозин.

Пепсин - високоактивна ендопептидаза, що діє на пептидні зв'язки, сформовані за участю ароматичних амінокислот (фенілаланіну, тирозину), лейцину та глутамінової кислоти або валіну. Під час споживання рослинної їжі, небагатої на білки, у шлунковому соку міститься дещо менша к-сть НСІ, що сприяє утворенню з пепсиногену II гастроксину, оптимум рН=2, 0-3, 0.

Хімозин (ренін, сичужний фермент) секретується залозами слизової оболонки шлунка молодих тварин і, ймовірно, немовлят. Виділяється він у вигляді прохімозину, який за рН 5, 0 перетворюється на активну форму. Хімозин перетворює казеїноген молока в нерозчинну кальцієву сіль казеїну за рахунок відщеплення пептиду. Згаданий комплекс довше перебуває у шлунку, що сприяє розщепленню його пепсином. Оптимум рН хімозину становить 3, 5-5, 0. Хімозин активується Са2+. У дорослих людей тварин, які вживають змішану їжу, хімозин є мало активним або його зовсім немає. Перетворення казеїногену на казеїн відбувається в цьому разі піддією пепсину.

Ацинарні клітини підшлункової залози, що становлять приблизно 99 % її маси, секретують комплекс ферментів, зокрема, проферменти трипсину та хімотрипсину - трипсиноген і хімотрипсиноген, а також карбоксипептидазу, що через вихідний протік залози надходять до дванадцятипалої кишки. Сік підшлункової залози - це складний хім секрет, який є лужною рідиною завдяки вмісту бікарбонатів.

Трипсин утворюється з трипсиногену шляхом розриву пептидного зв'язку між лізином та ізолейцином ентерокіназою з відщепленням N-кінцевого гексапептиду. Ентерокіназа продукується клітинами слизової оболонки тонкого кишечнику. Перетворення трипсиногену на трипсин каталізується також і трипсином, який утворився за рН 7, 0-8, 0. Трипсин є ендопептидазою й розщеплює третину усіх пептидних зв'язків, утворених переважно карбоксильною групою діаміно-монокарбонових кислот (аргініну, лізину) та аміногрупами інших амінокислот. Він гідролізує також складноетерні та амідні зв'язки, які утворені зазначеними амінокислотами.

Хімотрипсин утворюється з хімотрипсиногену, також належить до ендопептидаз і за фізико-хімічними властивостями подібний до трипсину. Його активація починається трипсином, який гідролізує зв'язок між ізолейцином та аргініном, завдяки чому утворюється а-хімотрипсин. Хімотрипсин гідролізує переважно пептидні зв'язки, в утворенні яких беруть участь карбоксильні групи ароматичних амінокислот - тирозину, Феніллаланіну й триптофану, а також ті, що сформовані метіоніном.

У підшлунковій залозі утворюються й інші ендопептидази, що, мабуть, як і хімотрипсин і карбоксипептидаза, активуються трипсином: еластаза, проферментом якої є проеластаза; колагеназа.

Екзопептидази знайдено в кишковому соку, слизовій оболонці тонкого кишечнику, тканинах нирок, печінки, молочної залози, а також у рослин і бактерій. Деякі екзопептидази виявилися металоферментами. Вони активуються Mg2+, Mn2+, Со2+, Zn2+, які, ймовірно, мають значення для утворення фермен-тсубстратного комплексу й інгібуються хелаторами згаданих катіонів.

Карбоксипептидаза є третім важливим протеолітичним ферментом, що секретується підшлунковою залозою в неактивній формі - прокарбоксипептидази. Активується вона трипсином у тонкому відділі кишечнику й каталізує відщеплення С-кінцевих амінокислот. Карбоксипептидаза гідролізує також етерні зв'язки. Інгібується вона лізином, аргініном і проліном. Окремі карбоксипептидази виявляють специфічність до основних амінокислот і є циклопептидами.

У слизовій оболонці тонкого відділу кишечнику знайдено амінопептидази, які аналогічно карбоксипептидазам гідролізують пептидні зв'язки N-кінцевих амінокислот і виявляють специфічність до окремих з них, наприклад, Мg2+-залежна лейцинамінопептидаза. Гідроліз харчових білків відбувається в порожнині кишечнику й на поверхні слизової оболонки (пристінне травлення). Білки, які не гідролізуються в тонкому відділі кишечнику, гідролізуються в товстому відділі бактеріальними пептидгідролазами. Цей процес називається гниттям білків.

У товстому відділі кишечнику розщеплюються тирозин, триптофан, цистеїн, аргінін, лізин, гістидин з утворенням протеїногенних амінів та інших речовин з токсичними властивостями: фенол, крезол, скатол та ін.

Процесінг первинних транскриптів. Механізми сплайсингу РНК. Особливості процесінгу тРНК, мРНК, рРНК у про- та еукаріотів. Регуляція експресії генів шляхом альтернативного сплайсингу.

Безпосереднім продуктом еукаріотичної РНК-полімерази ІІ є пре-мРНК – попередник функціональної мРНК. Пре-мРНК не може бути використана як матриця для білкового синтезу – принаймні тому, що вона містить у своєму складі інтрони. Дозрівання пре-мРНК з утворенням функціональної матриці називають процесингом, і полягає він у трьох операціях:

Кепування – модифікація 5'-кінця з утворенням так званого кепа (cap – капелюшок).

Перша стадія кепування: відщеплення одного фосфату (γ -фосфату) з 5'-кінця, що здійснюється фосфатазою.

Друга стадія: перенос гуанозинмонофосфату (GMP) з гуанозинтрифосфату (GTP) на два фосфатні залишки, що залишились на 5'-кінці (відповідний фермент – гуанілілтрансфераза). Результатом переносу є утворення ковалентного зв'язку між 5'-фосфатом GMP та 5'-кінцевим β -фосфатом пре-мРНК, тобто формування нехарактерного для нуклеїнових кислот зв'язку між нуклеотидами.

Третя стадія: метилювання метилтрансферазою кінцевого G з утворення 7-метилгуаніну (7mG).

Функціональне значення кепа є багатоплановим:

- Захист 5'-кн від деградації: зв'язкок між першими двома нуклеотидами непомітний для екзонуклеаз.

- Участь у інших реакціях процесингу: СВС стимулює сплайсинг першого інтрону та поліаденилування 3'-кінця (див. нижче).

- Транспорт мРНК у цитоплазму здійснюється завдяки взаємодії СВС з ядерною порою: саме своїм 5'-кінцем мРНК виштовхується у цитоплазматичний простір.

- Ініціація трансляції: саме кеп є первинною точкою збірки рибосоми та інших елементів ініціації білкового синтезу.

Сплайсинг – вирізання інтронів і зшивання екзонів – процес, у результаті якого мРНК стає копією лише кодуючої частини гена або її фрагментів: сплайсинг часто може відбуватися кількома альтернативними шляхами (альтернативний сплайсинг).

На кінцях переважної більшості інтронів розташовані стандартні динуклеотиди GU та AG, що знаходяться у складі певних консенсусних послідовностей. Ближче до 3'-кінця, перед піримидин-збагаченим треком довжиною ~15 нуклеотидів знаходиться ще один консенсус, до складу якого обов'язково входить аденіновий нуклеотид. Цей А є так званою точкою розгалуження (branchpoint), яка виконує особливу роль.

Сплайсинг інтрона полягає у послідовності двох хімічних реакцій трансестерифікації (заміни 1 фосфодіефірного зв. на ін.).

1. Аденіновий нуклеотид у точці розгалуження має підвищену реакційну здатність (унаслідок особливостей просторової структури інтрона, див. нижче). 2'-ОН група його рибози здійснює нуклеофільну атаку фосфату в 5'-сплайс сайті – на границі між лівим екзоном та інтроном. У результаті зв'язок між цим фосфатом та 3'-кінцевим нуклеотидом екзона замінюється на зв'язок між фосфатом та 2'-ОН групою аденінового нуклеотиду – у 5'-кінцевій частині інтрона утворюється так зване ласо).

2. ОН-група, що залишилася на 3'-кінці першого екзона атакує фосфодіефірний зв'язок у 3'-сплайс сайті. Цей зв'язок розривається, замінюючись на зв'язок між двома екзонами.

Оскільки число фосфодіефірних зв'язків не змінюється, реакція трансестерифікації є ізоенергетичною і не потребує АТР як джерела енергії. Але звичайно, обидві реакції сплайсингу потребують каталізу, і, на відміну від інших реакцій, що розглядалися досі, каталізаторами сплайсингу не виступають білкові ферменти.

Обидві реакції сплайсингу здійснюються у складі спеціальної мультимолекулярної структури – сплайсосоми (spliceosome), яка зв'язана з CTD і утворюється на кожному інтроні за участю самої пре-мРНК, білків та особливих молекул так званих маленьких ядерних РНК (smallnuclearRNA, snRNA).

Маленькі ядерні РНК, якісинтезуються РНК-полімеразою ІІ на відповідних генах, що згруповані у кластери, відіграють ключову роль у визначенні просторової структури, формуванні та функціонуванні сплайсосоми. У сплайсингу приймають участь п'ять типів маленької ядерної РНК (довжиною 100-200 нуклеотидів): U1, U2, U4, U5 та U6.

Отже, роль білків сплайсосоми зводиться до наступного:

- розкручування подвійних спіралей РНК АТР-залежними геліказами;

- стабілізація подв спіралей та загальної просторової структури сплайсосоми білками зі специфічною спорідненістю до РНК;

- регуляція сплайсингу – блокування чи підсилення ефективності збірки сплайсосоми на даному інтроні білками-регуляторами сплайсингу (SR, SplicingRegulators).

Після формування сплайсосоми здійснюється її структурна перебудова (АТР-залежне розплітання частини подвійних спіралей геліказами), результатом якої є безпосереднє наближення 5'-сплайс сайта до точки розгалуження: виникають умови для першої реакції трансестерифікації з утворенням ласо (див. також рис. 7.4). Хімічна перебудова інтрона викликає нову перебудову просторової структури сплайсосоми: за рахунок одночасної взаємодії з U5 наближуються один до одного кінці екзонів, що створює умови для другої трансестерифікації. На останньому етапі від двох вже з'єднаних екзонів АТР-залежним шляхом (порушення комплементарних взаємодій) видаляється комплекс інтрона з маленькими ядерними РНК.

За аналогією з білковими ензимами, молекули РНК, які мають каталітичну активність, називають рибозимами. Одним з таких рибозимів є сплайсосома. Як правило, каталітична активність рибозима (як і у випадку сплайсосоми) залежить від білків, які виконують допоміжні функції, стабілізуючи структуру активного центра.

Поліаденилування – приєднання до 3'-кінця polyА послідовності, яке тісно пов'язане з термінацією транскрипції.

Сигнал термінації транскрипції та поліаденилування (так званий polyA-сигнал) складається з двох елементів послідовності: консенсус AAUAAA і розташована в ~20 нуклеотидах нижче від нього U- або G/U-збагачена послідовність. Перший елемент впізнається гетеротетрамерним білком CPSF (Cleavage-PolyadenylationSpecificityFactor). Другий елемент polyA-сигналу впізнається фактором розрізання РНК СstF (CleavagestimulationFactor). Взаємодія обох факторів з РНК є кооперативною – вони підсилюють зв'язування одне одного.

Після перви впізнання polyA-сигналу, поки РНК-полімераза продовжує синтез РНК за сигналом (до 1000 нуклеотидів), до мультибілкового комплексу, що збирається на polyA-сигналі, долучаються polyA-полімераза (РАР), ще два фактори розрізання (СleavageFactors) CF 1 та 2 та, можливо, інші білки. Збірка комплексу стимулюється зв'язаним з кепом СВС, а також сплайсосомою на останньому інтроні – сплайсинг останнього інтрона та розрізання/поліаденилування РНК здійснюються одночасно й стимулюють одне одного. Зокрема, білок U2AF, що знаходиться на останньому інтроні, взаємодіє з РАР.

У межах другого елемента послідовності polyA-сигналу знаходиться консервативний динуклеотид СА, в якому й відбувається розрізання (сleavage) РНК. Від якої конкретно активності залежить це розрізання, залишається невідомим. До 3'-кінця, що з'явився внаслідок розрізу, РАР (при стимулюючій дії CPSF) приєднує один за одним 100-200 аденінових нуклеотидів. З polyA-хвостом, що зростає, відразу зв'язується специфічний білок РАВР (PolyABindingProtein), який підвищує процесивність РАР.

Загальна схема будови зрілої мРНК. Між кепом та початком кодуючої ділянки (стартовим кодоном – найчастіше AUG) розташована 5'-кінцева зона, що не транслюється (5' UTR). За кодуючою ділянкою, що закінчується одним із стоп-кодонів, і перед polyA-послідовністю знаходиться 3'-кінцева зона, що не піддається трансляції. Обидві зони, що не транслюються, містять важливі елементи послідовності, які використовуються для регуляції білкового синтезу.

Майже єдиним виключенням серед інших еук мРНК є гістонові мРНК, які не піддаються сплайсингу (гістонові гени не містять інтронів) та поліаденилуванню 3'-кн. Термінація транскрипції гістонових генів залежить від 2 сигнальних елементів послідовності РНК: один утв шпильку, інший спарюється з маленькою ядерною РНК U7; між цими елементами індукується розріз. Аналогічно відбувається термінація транскрипції маленьких ядерних РНК, які також не піддаються поліаденилуванню.

Альтернативний сплайсинг. Пре-мРНК, що синтезується під час транскрипції, може піддаватися сплайсингу та поліаденилуванню по різних альтернативних шляхах: кілька екзонів на початку чи всередині гена можуть вирізатися з транскрипту, транскрипт може обрізатися та піддаватися поліаденилуванню за рахунок використання polyA-сигналу всередині одного з інтронів тощо. У результаті утворюються різні молекули мРНК, що містять різні набори екзонів та, відповідно, кодують різні білки. Багатокомпонентність (та необхідність кооперації між компонентами) сплайсосоми та системи розрізання/поліаденилування дозволяє здійснювати тонку регуляцію утворення мРНК певного типу за рахунок зміни транскрипційної активності генів, що кодують ті чи інші компоненти машинерії процесингу, зміни концентрацій компонентів, їх хімічної модифікації.

Ключова роль у визначенні шляху сплайсингу належить білкам-регуляторам сплайсингу (SR). У випадку негативної регуляції зв'язування регулятора утруднює впізнання сплайс сайтів. Наприклад, взаємодія з регулятором ініціюється всередині екзона, молекули білка кооперативно зв'язуються поруч одна з одною і в решті решт блокують 3'-сплайс сайт. Замість заблокованого сприймається наступний такий сайт, і екзон вирізається з молекули.

Сплайсинг-регулятори можуть також мати сайти зв'язування в інтронах, впливаючи на ефективність збірки сплайсосоми. Регулятор може блокувати, наприклад, 3'-сплайс сайт: якщо така блокада відсутня, сайт сприймається, при наявності регулятора сприймається інший 3'-сплайс сайт всередині екзона – у складі мРНК залишається скорочений екзон.

Процесинг пре-рРНК – це кластер трьох rRNA: 18S, 5.8S та 28S у ссавців. Вони повинні бути розділені для набуття активності.Роль в розщепленні pre-rRNA також грають U3 snRNA, та іншіU-багатіsnRNAs.

5SrRNAсинтезується в нуклеоплазмі і не потребує процесингу. Після того, як 5SrRNA входить в ядерце і об’єднується з 28Sта 5.8SrRNAs, відповідно формується велика субодиниця рибосоми.

Пре-тРНК потребує досить значних модифікацій, щоб утворилася зрілаtRNA. Відомі чотири типи модифікацій:

Видалення додаткового сегмента біля 5' кінцяРНКазою P. Видалення інтрону (~ 14 nucleotides) в атикдоновій петлі шляхом сплайсингу. Видалення двохUзалишків на 3'кінціза допомогою CCA додаючого ензиму, який знайдений у всіхtRNAs.

Модифікація деяких залишків на відповідні основи, напр.інозин, дегідроуридин, псевдоуридин.

Процесниг РНК у про- та еукаріотів. Все, що було наведено вище, стосується процесингу РНК у еукаріотів. Стосовно прокаріотів, схема дозрівання рРНК і тРНК досить схожа. Щодо мРНК прокаріотів, то 5-кеп відсутній, інтронів немає (відповідно відсутній сплайсинг), полі-А хвіст часто відсутній. До речі, мРНК прокаріотів, на відміну від еу-, часто є поліцистронною, тобто може містити інформацію про більш ніж один білок у одній молекулі РНК. Тобто тут не виконується закон одна мРНК – один білок.