Количественное определение общего билирубина в сыворотке крови по методу Ендрассика и Клехгорна.

Цель работы: ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина в сыворотке крови.

Мотивация: Билирубин - продукт ферментативного окисления гемоглобина (конечный продукт распада гема), образующийся в результате естественного распада эритроцитов в клетках РЭС, относится к группе желчных пигментов. Билирубин - вещество токсичное, т.к. молекула билирубина является гидрофобной и может проникать в клетки головного мозга. Поэтому в организме человека существуют реакция обезвреживания билирубина, которая протекает в печени.

где УФДГК - кофермент уридиндифосфат глюкуроновая кислота, УДФГТ - фермент уридиндифосфатглюкуронилтрансфераза.

Билирубиндиглюкуронид экскретируется с желчью в ЖКТ, где высвобождается из коньюгата, восстанавливается до уробилиногена, затем превращается в стеркобилиноген, в форме которого и выводится из организма человека.

Принцип метода: в основе определения билирубина лежит реакция азосочетания билирубина с диазосмесью Эрлиха, в результате которой появляется малиновокрасная окраска за счет образующегося азобилирубина. Концентрация последнего определяется фотоколориметрически.

Билирубиндиглюкуронид реагирует с диазосмесью непосредственно (² прямой билирубин² по старой терминологии), тогда как свободный билирубин неустойчив в растворе в сильно кислой среде, при которой происходит реакция азосочетания и требует присутствия стабилизатора, роль которого могут играть кофеин, спирт, мочевина, ацетат, бензонат натрия и др. (² непрямой билирубин²).

Реактивы и оборудование:

1. Химические пробирки, бюретки, пипетки на 10мл и 1 мл; 2. Раствор сульфаниловой кислоты 0, 5%; 3. Раствор нитрита натрия 0, 5% (готовится еженедельно); 4. Кофеиновый реактив: кофеина чистого 5г, бензойнокислого натрия – 37, 5г, уксуснокислого натрия – 62, 5г, растворяются при нагревании: раствор доводится дистиллированной водой до 1л; 5. Сыворотки крови с различными концентрациями билирубина.

Ход работы: в химическую пробирку из бюреток отмеривают 1 мл сыворотки и 2, 5 мл кофеинового реактива. Диазосмесь готовят в одной пробирке на всю группу следующим образом: 10 мл 0, 5% раствора сульфаниловой кислоты и 0, 25мл 0, 5% нитрита натрия отмеривают пипеткой в пробирку из склянки на столе преподавателя. Готовую диазосмесь отмеривают пипеткой по 0, 5мл в каждую пробу с сывороткой. Содержимое пробирки перемешивают и ставят на 20 минут в темноту, затем фотометрируют с зеленым светофильтром (длина волны 530 нм), в кюветах 10 мм против контрольной пробы, в которой вместо сыворотки используют 1 мл дистиллированной воды.