Методика первичного посева

Присланные для микробиологического исследования пробы зачища­ют от жировой и соединительной ткани, окунают в спирт и фламбируют. Затем стерильными ножницами из середины пробы вырезают куски мяса или органов размером 1.5 х 2, 0 х 2, 5 см. На пластинчатые среды (МПА и элективные) посев делают кусочком ткани либо взве­сью ткани.

Кусочек пробы размером 1, 5 ж 2, 0 х 2, 5 см берут стерильным пин­цетом. Затем крышку чашки Петри немного приоткрывают и слегка касаются в шахматном порядке разными сторонами кусочка пробы поверхности питательной среды.

Таблица 10.

Рост возбудителей пищевых токсикоинфекции на элективных средах и МПА

Для посева на среду накопления пробу измельчают профламбированными ножницами, затем заполняют получившимися кусочками пробы пробирки со средой накопления на 2/3.

Для посева на скошенный МПА с капелькой конденсата по Шукевичу профламированой бактериологической петлей берут кусочек пробы размером с просяное зернышко и осторожно вносят его в ка­плю конденсата, не касаясь поверхности среды.

При наличии в лаборатории гомогенизатора из присланных проб го­товят взвесь 1: 1. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая — из ку­сочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки). Каждую пробу в отдельности помешают в стерильный стакан (колбу) гомогени­затора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 мл физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогениза­торе, 1 мл приготовленной взвеси содержит 0, 5 г продукта.

Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надоса-дочной жидкости пипеткой Пастера или петлей вносят на чашку с мя-сопептонным агаром и элективной средой (Эндо, Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.

Одновременно с посевом на плотные среды производят посев мате­риала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (Мюл­лера, Кауфмана, Киллиана). Для этого 20 мл взвеси из мышц и лим­фатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 мл взвеси из паренхиматозных органов — в другой. В каждый флакон наливают по 50 мл среды обогащения.

После проведения первичных посевов чашки Петри и пробирки со средами подписывают и помещают в термостат на 18-24 часа при температуре 37°С. Инкубация сред накопления сальмонелл проводит­ся в течение 12—16 часов.

Занятие 2. Учет первичных посевов, изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств возбудителей пищевых токсикоинфекции

Цель занятия: изучить морфологические, культуральные и биохими­ческие свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции; отработать методики изучения морфологических, культуральных и биохимиче­ских свойств возбудителей пищевых токсикоинфекций.

План работы:

1. Произвести учет роста возбудителей пищевых токсикоинфекций на первичных посевах.

2. Изучить морфологические свойства возбудителей пищевых ток­сикоинфекций (приготовление и изучение мазков из колоний, окрашенных по Граму, изучение подвижности бактерий на пре­парате «висячая капля»).

3. Изучить культуральные свойства возбудителей пищевых токси­коинфекций.

4. Изучить биохимические свойства возбудителей пищевых токси­коинфекций.

5. Произвести посевы на среды короткого и длинного пестрого ря­дов и трехсахарный агар.

Материальное обеспечение: среды с первичными посевами, сделан­ными студентами на предыдущем занятии, ножницы, анатомический пинцет, микроскоп, термостат, пробирки (10 шт.), предметные стекла, покровные стекла, стекло с лункой, бактериологическая петля, пасте­ровские пипетки, бактериологический мостик, простоквашница, га­зовая горелка (спиртовка), иммерсионное масло, фуксин, генцианвиолет, йодированный спирт, раствор Люголя, фильтровальная бумага, вода дистиллированная, раствор для дезинфекции рук, среды длинно­го пестрого ряда, трехсахарный агар с индикатором «ВР», изотоничес­кий раствор натрия хлорида, таблицы «Длинный пестрый ряд», «Рост возбудителей токсикоинфекций на трехсахарном агаре», «Биохими­ческие свойства возбудителей токсикоинфекций».

Учет первичных посевов

После инкубации в термостате проводят учет первичных посевов, из­учая культуральные свойства выросших колоний бактерий, их размер, форму, цвет, а также отмечают изменения цвета и других характери­стик питательных сред. Вначале изучают рост бактерий на пластинча­том М ПА, поскольку на простых средах растет большинство бактерий. При обнаружении на МПА колоний, напоминающих по внешне­му виду колонии возбудителей, из них готовят мазки, окрашивают их по Граму или специальными методами окраски, используемыми для определенных микроорганизмов, а также определяют подвижность микроорганизмов при помощи препаратов «висячая капля» или «раз­давленная капля». Если по совокупности культуральных и морфологи­ческих свойств исследуемые микроорганизмы соответствуют какому-либо возбудителю инфекционных болезней, то необходимо провести полный комплекс микробиологических исследований для его под­тверждения. Затем изучают рост бактерий на элективных средах. Воз­будители пищевых токсикоинфекиий на элективных средах растут особым образом (см. табл. 10), что позволяет определить, к какому роду они принадлежат.

Для изучения морфологических свойств возбудителей пищевых ток­сикоинфекций, выросших на элективных средах, из специфических колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму, а также определя­ют подвижность микроорганизмов при помощи препаратов «висячая» или «раздавленная капля». При учете роста на скошенном МПА по Шукевичу обращают внимание на наличие ползучего роста на скосе, характерного для бактерий рода Proteus.

Если на твердых средах рост возбудителей пищевых токсикоинфек­ций не был обнаружен, то делают повторный посев со среды накопле­ния сальмонелл.

Методика приготовления мазков

из колоний микроорганизмов

Профламбированой бактериологической петлей берут среднюю каплю стерильного изотонического раствора и помещают ее на предметное стекло. Затем фламбируют бактериологическую петлю, охлаждают и отбирают маленький кусочек исследуемой колонии микроорганизмов и переносят ее в каплю изотонического раствора на предметном стекле. После этого тщательно перемешивают и растирают каплю по поверх­ности стекла. Приготовленный таким образом мазок фиксируют над пламенем горелки и подвергают окраске по Граму или др.

Определение подвижности возбудителей пищевых сикоинфекций методом «висячей капли»

Профламбированой бактериологической петлей берут маленькую кап­лю стерильного изотонического раствора и помешают ее на покровное стекло. Затем фламбируют бактериологическую петлю, охлаждают и отбирают маленький кусочек исследуемой колонии микроорганизмов,

переносят ее в каплю изотонического раствора на покровном стекле и осторожно перемешивают. Берут стекло с лункой и смазывают края лунки вазелином. Осторожно переворачивают покровное стекло та­ким образом, чтобы капля оказалась над лункой. Покровное стекло осторожно притирают к краям лунки. На готовый препарат «висячая капля» капают иммерсионное масло и микроскопируют при большом увеличении микроскопа (630—900 раз) при приспущенном конденсо­ре. Препарат «висячая капля» не окрашен, поэтому бактерии полупро­зрачные, бледно-серого цвета. При определении подвижности бакте­рий следует наблюдать за отдельными бактериями, чтобы отличать их целенаправленное движение от броуновского.

Морфологические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции

Бактерии рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae - факуль­тативные анаэробы, мелкие стройные грамотрицательные палоч­ки с закругленными краями с длиной 2—4 мкм и шириной 0, 5 мкм, спор и капсул не образуют. В настоящее время насчитывается око­ло 2300 серотипов сальмонелл. Большинство серотипов сальмонелл подвижны, за исключением S. gallinarum, S. pullorum.

Бактерии рода E. coli^: - факультативные анаэробы, грамотрииатель­ные, подвижные палочки с закругленными краями длиной 2-4 мкм и шириной 0, 2-0, 7 мкм, выделяют экзотоксин и эндотоксин. Бактерии группы EL coli в течение длительного времени сохраняются во вне­шней среде, а при температуре выше +10°С активно размножаются, обладают средней устойчивостью к действию высоких температур, а экзотоксин термостабилен. В настоящее время насчитывается более 300 серотипов кишечной палочки.

Бактерии рода Ptoteus - факультативные анаэробы, грамотрииатель­ные, очень подвижные полиморфные палочки с длиной 1—3 мкм и ши­риной 0, 2-0, 7 мкм, спор и капсул не образуют. Наибольшее практичес­кое значения имеют: Е vulgaris, P. mirabilis, и близкие к ним Morganella morgani, Providencia rettgery, Providencia stuarty.