Лабораторное занятие 4

Задание: определить бактериальную обсеменённость молока.

Приборы и реактивы: стерильные пробирки, пробы молока, редуктазник, рабочий раствор метиленовой сини, 0, 005% раствор резазурина, резиновые пробки.

1. Проба на редуктазу с метиленовой синью. ГОСТ 9225-84

Сущность метода основана на определении биохимической активности микробов, продуцирующих фермент редуктазу. Редуктаза обладает способностью обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь. Однако не все микроорганизмы обладают восстановительной активностью. В большей степени этим свойством обладают молочнокислые стрептококки, кишечная палочка, масляно-кислые и гнилостные бактерии. Несколько меньше – сальмонеллы и стафилококки, а патогенные стрептококки лишены этой способности.

Приготовление основного спиртового раствора метиленовой сини.

10 г метиленовой сини залить 100 cм³ спирта и оставить в термостате на сутки при 37°С. Профильтровать. Стандартный рабочий раствор готовят из основного: к 5 cм³ этого раствора прибавить 195 cм³ дистиллированной воды.

Техника определения:

1. В чистую пробирку налить 1 cм³ рабочего раствора метиленовой сини и 20 cм³ исследуемого молока, закрыть пробкой и хорошо перемешать.

2. Пробирку с молоком поместить в редуктазник с температурой воды 38-40°С уровень воды в редуктазнике должен быть выше уровня молока в пробирке, необходимо постоянно поддерживать температуру воды

3. Проверять время обесцвечивания проб через 40 минут, 2, 5 часа и через 3, 5 часа. Окончанием испытания на редуктазу считать момент, когда молоко в пробирках обесцветиться. Наличие небольшого окрашенного кольцеобразного слоя наверху или окраска небольшой части внизу в расчёт не принимаются.

Молоко по количеству микрофлоры делят на 4 класса.

Таблица 10.

Определение класса бактериальной загрязнённости молока

(с метиленовой синью)

2. Проба на редуктазу с резазурином.

Готовят основной раствор резазурина: 10 мг резазурина растворяют в 200 cм³ дистиллированной воды и хранят в холодильнике до 30 суток при температуре 3-5⁰С. Рабочий раствор готовят, разбавляя основной раствор дистиллированной водой в соотношении 1: 10, он содержит 0, 005% резазурина.

Техника определения: В чистую пробирку отмеривают 10 cм³ молока, добавляют 1 cм³ 0, 005%-ного рабочего раствора резазурина. Пробирку закрывают пробкой, осторожно перемешивают содержимое, ставят на водяную баню при температуре 37°С±1°С и в течение 1 и 1, 5 часа наблюдают за изменением окраски. Интенсивность окраски содержимого пробирки определяют путём сравнения с данными таблицы №11.

Таблица 11.

Количество бактерий в молоке и его класс по редуктазной пробе с

резазурином

Факторы, влияющие на точность определения:

1. Неправильно приготовленный раствор метиленовой сини или резазурина

2. Низкая температура в водяной бане

3. Грязные пробирки

4. Неплотно закрытые пробирки

Выполнить самостоятельно:

1. Определить бактериальную обсеменённость молока с метиленовой синью и резазурином

Лабораторное занятие 7

Задание: Освоить методы контроля натуральности и пастеризации молока.

Приборы и реактивы: Пробы молока, пробирки, пипетки на 5, 2, 1 cм³, цилиндры на 250 cм³, молочный ареометр, 0, 2%-ный спиртовой раствор розоловой кислоты; 0, 04%-ный раствор бромтимолового синего, реактив Несслера, 3-4%-ная настойка йода, йодисто-калиевый крахмал, 10%-ный раствор уксусной кислоты, фенолфталеинфосфат натрия.

Молоко считается фальсифицированным, если к нему добавлены посторонние вещества или снят жир. Различают характер фальсификации, т.е. что добавлено к молоку, и степень фальсификации молока – количество добавленных посторонних веществ.

Для определения характера и степени фальсификации молока необходимо знать в исследуемой и стойловой пробах содержание жира, сухого вещества и СОМО, плотность молока.

Фальсификация водой. При добавлении в молоко воды снижается содержание сухого вещества, СОМО, жира, а также плотность и кислотность. Степень фальсификации рассчитывают по формуле:

В=(СОМО - СОМО₁)/СОМО *100 или В= (Д-Д₁)/Д * 100;

Где: В – количество воды, добавленной к молоку, %

СОМО – показатель стойловой пробы, %

СОМО₁ – показатель исследуемой пробы, %

Д – плотность молока стойловой пробы (°А)

Д₁ – плотность молока исследуемой пробы (°А)

Установлено, что добавление в молоко 10% воды снижает плотность на 3°А.

Фальсификация молока обезжиренным молоком или снятием сливок.

При добавлении обезжиренного молока или снятии сливок плотность повышается, содержание сухого вещества и жира снижается, СОМО не изменяется или слегка повышается. Степень фальсификации рассчитывают по формуле: О = (Ж –Ж₁)/Ж * 100,

Где: О – количество добавленного обезжиренного молока, %

Ж – количество жира в стойловой пробе, %

Ж₁ – количество жира в исследуемой пробе, %

Для большей достоверности при установлении характера фальсификации в случае добавления обезжиренного молока производят расчёт по формуле:

Ж_св=Ж₁/С₁ * 100,

Где: Ж_св – содержание жира в сухом веществе молока, %

С₁ – содержание сухого вещества в молоке исследуемой пробы, %

Наличие в сухом веществе молока менее 25% жира указывает на то, что к нему добавлено обезжиренное молоко или сняты сливки.

Двойная фальсификация.

При одновременном добавлении к молоку воды и обезжиренного молока содержание сухого вещества, СОМО, и жира снижается, а плотность не изменяется. Степень фальсификации определяют по формулам:

Д= 100 – (Ж₁/Ж * 100); В = 100 – (СОМО₁/СОМО * 100); О= Д – В;

Где: Д – количество воды и обезжиренного молока, %

Пример. При исследовании проб молока получены такие результаты:

Д=100 – (2, 0/3, 8 * 100)= 47, 4%

В=100 – (8, 31/9, 02 * 100)=8%; О=47, 4 – 8=39, 4%

При фальсификации молока с добавлением воды или подснятием сливок, в молоке возникают следующие изменения.

Таблица 15.

Изменения в молоке при фальсификации

1.Определение в молоке соды (ГОСТ 24065-80)

Для снижения кислотности (раскисления) молока к нему добавляют питьевую соду. При фальсификации повышается pH молока и возникает нейтральная или щелочная реакция. Это можно установить с помощью индикаторов:

А) проба с бромтимоловым синим

В пробирку налейте 5 cм³ испытуемого молока и осторожно по стенке добавьте 7-8 капель раствора бромтимолового синего.

Через 10 минут наблюдайте за изменением окраски кольцевого слоя. При отсутствии соды кольцевой слой имеет жёлтую окраску, при добавлении соды - зеленую. Этим методом можно обнаружить содержание соды до 0, 05%.

Б) проба с розоловой кислотой.

В пробирку вносят равные объемы молока и 0, 2%-ный раствор розоловой кислоты. В присутствии соды молоко окрашивается в малиновый цвет, без соды - в оранжевый.

2.Определение в молоке крахмала

Для увеличения вязкости молока (его густоты) к нему добавляют крахмал или муку. В пробирке смешайте 5 cм³ молока и 3 капли настойки йода или люголевского раствора. При наличии крахмала молоко окрашивается в синий цвет, а при его отсутствии в бледно-желтый.

3.Определение в молоке формалина

Формалин добавляют в молоко как консервирующее вещество.

В пробирку отмерьте 2 cм³ смеси серной кислоты с азотной и по стенке добавьте 2 cм³ молока. При наличии формалина на границе соприкасающихся жидкостей образуется фиолетовое кольцо, а при отсутствии- жёлтое.

4. Определение в молоке перекиси водорода (ГОСТ 24067-80)

Перекись водорода добавляют в молоко для его консервации.

В пробирку отмерьте 1 cм³ молока, прибавьте 4 капли йодисто-калиевого крахмала, размешайте и прибавьте 1 каплю серной кислоты.

При наличии перекиси водорода в молоке появляется синий цвет, а при отсутствии – цвет не изменяется.

5. Определение в молоке аммиака (ГОСТ24066-80)

Метод позволяет установить содержание аммиака до 6-9мг%.

А) В стакане отмерьте 20 cм³ молока и нагрейте в течение 2-3 мин на водяной бане при 40-45°С, затем внесите 1 cм³ 10%-ного раствора уксусной кислоты и оставьте в покое на 10 минут (для осаждения казеина)

Б) В пробирку отберите пипеткой через вату 2 cм³ отстоявшейся сыворотки и добавьте к ней 1 cм³ реактива Несслера. Содержимое пробирки перемешайте и в течение 1 мин наблюдайте. Появление лимонно-жёлтого окрашивания указывает на наличие аммиака в норме, оранжевая окраска указывает на содержание аммиака выше нормы.

Контроль пастеризации молока.

В практике часто возникает необходимость контроля проведения пастеризации молока и её эффективности.

При нагревании (пастеризации) молока в нём разрушаются ферменты, в том числе пероксидаза и фосфатаза. Наличие этих ферментов в молоке указывает на отсутствие пастеризации или нарушение режима пастеризации.

А) Проба на фосфатазу

Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия ферментом фосфатазой. Освобождающийся фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание.

В пробирку налейте 2 cм³ молока и 1 cм³ рабочего раствора фенолфталеинафосфата натрия, перемешайте и поставьте на 1 час в водяную баню 40-45°С не пастеризованное молоко или молоко с нарушенным режимом пастеризации окрашивается в розовый цвет. Пастеризованное молоко остаётся белым.

Б) Проба на пероксидазу

Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой. Освободившийся кислород окисляет йодистый калий, освободившийся йод образуют с крахмалом соединение синего цвета.

Пероксидаза разрушается при нагревании молока до 75°С и выше.

В пробирку налейте 5 cм³ молока, 5 капель раствора йодисто-калиевого крахмала и 5 капель 0, 05%-ного раствора перекиси водорода, содержимое перемешайте. Не пастеризованное молоко окрашивается в синий цвет, пастеризованное остаётся белым.

В) Лактоальбуминовая проба

Основана на свойстве альбуминовой фракции белка свёртываться при нагревании выше 80°С.

В колбочку возьмите 5 cм³ молока, 20 cм³ воды и 3 cм³ 0, 1 н раствора серной кислоты. Осадок казеина отфильтровать, в пробирку налейте 5 мл фильтрата и прокипятите. Хлопьев нет – молоко пастеризованное при температуре выше 80°С. при наличии хлопьев – молоко сырое или пастеризованное при низких температурах.

Выполнить самостоятельно:

1. Определить наличие посторонних примесей в молоке

2. Результаты анализа занести в таблицу 16

Таблица 16.

Наличие посторонних примесей.

Лабораторное занятие 8

Задание: 1. Освоить методы определения молока, полученного от больных

коров.

2. Освоить методы установления примеси анормального молока в сборном.

3. Освоить метод выявления в молоке антибиотиков.

Приборы и реактивы: Молочно-контрольная пластинка, уленгутовские пробирки, стеклянные палочки, 5%-ный раствор димастина, 4%-ный раствор едкого натра, 2, 5%-ный раствор препарата «Мастоприм», реактив Росса, бруцеллёзный антиген, маститопроб, маститодиагност, вискозиметр ВМЛК.

Мастит – воспаление молочной железы. Лабораторная диагностика маститов основана на выявлении физико-химических изменений молока, увеличении в нём количества соматических клеток (лейкоциты, эпителиальные клетки) и выделении возбудителя. Молоко от здоровых коров в среднем периоде лактации имеет слабокислую реакцию (pH6, 3-6, 9). При заболевании коров маститом реакция молока в большинстве случаев становиться щелочной (pH 7, 0 и выше).

Молоко, полученное от животных, больных маститом, можно обнаружить с помощью постановки проб с мастидином, димастином, маститодиагностом, маститопробом, пробой Уайтсайда и при помощи специальных приборов.

А) Проба с димастином

Реактив димастин состоит из сульфанола, гипосульфита натрия, глауберовой соли, фенолово - красного индикатора. Для исследований готовят 5%-ный раствор на дистиллированной воде.

Техника определения:

В каждое углубление пластинки МКП-1 из соответствующей четверти вымени надаивают по 1 cм³ молока и добавляют 1 cм³ приготовленного раствора димастина. Смесь молока с реактивом перемешивают в каждой луночке в течение 10-15 сек.

Реакцию учитывают по консистенции сгустка и цвета смеси:

- реакция отрицательная - однородная жидкость оранжевого, оранжево-красного цвета, pH 6, 5-6, 8

- реакция сомнительная – следы образования желе, цвет красный, pH 6, 8-7, 0

- реакция положительная – ясно видимый плотный сгусток алого или пунцового цвета, pH выше 7, 0

Б) Проба с 10%-ным раствором мастидина.

Техника постановки аналогична, как с 5%-ным раствором димастина.

- реакция отрицательная – однородная жидкость светло – сиреневого (дымчатого) цвета;

- реакция сомнительная – следы образования желе, почти белого цвета;

- реакция положительная – ясно видимый плотный сгусток, тёмно – сиреневого цвета.

В) Проба с маститодиагностом.

Маститодиагност представляет собой смесь сульфанола, триполифосфата натрия, водорастворимого бромтимолового синего и розоловой кислоты. В сухом виде индикатор сохраняет активность в течение 5 лет, а в растворе при температуре 3-5°С – до трёх лет. Индикатор готовят следующим образом: в 1 л дистиллированной воды, подогретой до 70-76°С, растворяют 50г триполифосфата натрия и 300г порошкообразного сульфанола. Когда смесь раствориться и раствор остынет до температуры 20-25 °С, добавляют 0, 2г водорастворимого бромтимолового синего и 5 cм³ 1%-ного спиртово-водного раствора розоловой кислоты. После взбалтывания индикатор готов к употреблению.

Техника определения. В молочно-контрольную пластину или в пробирку наливают 1 cм³ маститодиагноста и 1 cм³ молока, перемешивают 3-5 сек. Учёт реакции проводят по таблице 17.

Таблица 17.

Учёт реакции с индикатором маститодиагностом

Г) Исследование молока с маститопробом.

Маститопроб изготовляют из стирального порошка «Лотос». Для приготовления индикатора 300г порошка «Лотос» растворяют в 1, 5 л горячей воды. Для лучшего растворения смесь подогревают до кипения (кипятят около 1 мин), отстаивают 3-4 часа, затем отстоявшуюся жидкость фильтруют, а осадок выбрасывают. Полученный индикатор не теряет активности в течение 3-5 лет.

Техника определения. В молочно-контрольную пластину наливают 1 cм³ маститопроба и 1 cм³ молока. Учёт реакции через несколько секунд. При положительной реакции образуется слизистая масса или желеобразный сгусток, сомнительная – наличие единичных слизистых нитей, отрицательная – гомогенная жидкая смесь.

Д) Проба Уайтсайда.

Для постановки реакции используют 4 % раствор едкого натра.

Техника определения. В молочно-контрольную пластину наливают 1 cм³ молока и 0, 2 cм³ 4%-ного раствора NaOH. Учёт реакции через несколько секунд. При положительной реакции образуется густая тягучая масса с хлопьями, отрицательная – гомогенная жидкая смесь.

Ж) Определение кетоновых тел.

В молоке здоровых коров кетоновые тела отсутствуют. Появляются они в нём при нарушении у животного обмена веществ, возникающего чаще всего из-за белкового перекорма.

Техника определения. В пробирку налить 5 cм³ молока и добавить 1г реактива Росса (состоящего из 1г нитропруссида натрия и 100г хлористого аммония) и один кристаллик едкого натра. Через 5 мин оценивают реакцию. При наличии кетоновых тел появляется сиреневый цвет. При отсутствии – цвет желтоватый.

З) Определение молока коров, больных бруцеллёзом.

Кольцевая реакция. При добавлении в молоко больных бруцеллёзом коров антигена, окрашенного гематоксилином, происходит взаимодействие с антителом с образованием окрашенного в синий цвет кольца на поверхности содержимого пробирки.

Техника определения. В уленгутовскую пробирку наливают 1 cм³ исследуемого молока и добавляют 1 каплю окрашенного антигена. Содержимое встряхивают и ставят в термостат (37°С) на 40 мин.

Положительная реакция – кольцо окрашено в синий цвет, содержимое пробирки просветляется.

Отрицательная – равномерное окрашивание содержимого пробирки.

Сомнительная – слабо окрашенное кольцо, содержимое не просветляется.

2. Определение примеси анормального молока в сборном

(ГОСТ 23453-90)

Анормальным считается молоко с примесью молозива, а также полученное от коров в последние 7 суток лактации (стародойных), больных маститом или при патологическом состоянии организма животного, при котором увеличивается количество соматических клеток в молоке.

Метод основан на взаимодействии препарата «Мастоприм»с соматическими клетками, в результате чего изменяется консистенция молока. Сборное молоко, полученное от здоровых коров, содержит в 1 см³ до 500 тыс. соматических клеток, молоко с примесью анормального – свыше 500 тыс. соматических клеток в 1 см³.

Подготовка к анализу. Приготовление водного раствора препарата «Мастоприм»: 2, 5г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100см³ и доливают до метки дистиллированной водой, нагретой до 30-35°С. Раствор перед применением взбалтывают до равномерного распределения осадка. Срок годности раствора 1 сутки при температуре хранения 10-30°С.

Техника определения. В луночку пластинки ПМК-1 вносят 1 cм³ тщательно перемешанного молока и добавляют 1 cм³ 2, 5%-ного раствора препарата «Мастоприм». Молоко с препаратом интенсивно перемешивают стеклянной, пластмассовой палочкой в течение 10 с полученную смесь поднимают палочкой вверх на 5-7 см и проводят оценку результатов по таблице 18

Таблица 18

Учёт реакции с «Мастопримом»

Метод определения количества соматических клеток в молоке с применением вискозиметра ВМЛК.

Подготовка к анализу. Приготовление водного раствора «Мастоприм»:

3, 5г препарата вносят в мерную колбу вместимостью 100см³ и доливают до метки дистиллированной водой, подогретой до 30-35°С. раствор перед применением взбалтывают, срок годности – 1 сутки при температуре 10-30°С.

Техника определения. В сосуд прибора наливают 5 cм³ водного раствора препарата «Мастоприм» и 10 cм³ молока. Нажать на кнопку «Пуск», произвести перемешивание смеси в течение 30 сек. По окончании перемешивания через капилляр происходит вытекание смеси. Время вытекания определяется таймером. Количество соматических клеток устанавливают по времени вытекания смеси, согласно схеме:

3. Определить наличие в молоке антибиотиков

В молоко антибиотики попадают при лечении маститов и других заболеваний коров. Метод основан на подавлении размножения бактериальных клеток, на снижении выделения ферментов, обесцвечивающих добавленных к молоку индикатор.

Проба с метиленовым голубым. Взять две пробирки. В одну из них отмерить 10 cм³ исследуемого молока, 1 cм³ рабочего раствора метиленового голубого, добавить 3-4 свежей культуры термофильного стрептококка. В другую пробирку (контрольную) отмерить 10 cм³ молока, заведомо свободно от антибиотиков, 1 cм³ метиленового голубого и добавить 3-4 капли культуры термофильного стрептококка.

Содержимое пробирок размешать и поставить в водяную баню при температуре 38-40 ⁰С на 5, 5 ч.

Осмотреть пробирки и сделать заключение о качестве молока. Если в молоке имеется антибиотики, то термофильный стрептококк не развивается, фермента обесцвечивающего индикатор, не образуется, следовательно, молоко будет иметь синий цвет. Если антибиотик отсутствует, то добавленный метиленовый голубой обесцветится и цвет исследуемого молока будет такой же как и в контрольной пробирке.

Резазуриновая проба:

1. В одну из пробирок отмерить 10 cм³ исследуемого молока, 1 cм³ раствора резазурина, добавить 3-4 капли термофильного стрептококка, чувствительного к антибиотикам. В другую пробирку (контрольную) отмерить 10 cм³ молока, заведомо свободного от антибиотиков, 1 cм³ резазурина, добавить 3-4 капли термофильного стрептококка.

2. Содержимое пробирок размешать, поставить водяную баню при температуре 40⁰С на 45 мин.

3. Сделать заключение о качестве молока. Сине-стальной или фиолетово-розовый цвет испытуемого молока в пробирке указывает на наличие антибиотиков в молоке; отсутствие окрашивания свидетельствует о том, что в молоке нет антибиотиков.

Выполнить самостоятельно:

1. Произвести исследование молока с димастином, мастидином, маститодиагностом, маститопробом.

2. Определить наличие кетоновых тел в молоке больных и здоровых коров.

3. Определить наличие примесей анормального молока в сборном.

4. Определить наличие в молоке антибиотиков.