Влияние экспрессии антисмысловых РНК на фенотип трансгенных мышей

Таблица II.3 (окончание)

Использование антисмысловых РНК для исследования онтогенеза животных выявило высокую чувствительность определенных его стадий к изменению уровня экспрессии генов, а также неспецифическую токсичность антисмысловых транскриптов, проявляющуюся за счет взаимного влияния различных частей ранних эмбрионов друг на друга и гетерогенности экспрессии самих антисмысловых РНК в развивающихся зародышах. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных при экспрессии антисмысловых РНК в раннем эмбриогенезе. Поэтому более удобными объектами для получения фенокопий являются культивируемые соматические клетки животных и растений.

Исследование клеточного цикла. Антисмысловые РНК оказались полезными в исследованиях роли протоонкогенов и факторов роста в пролиферации клеток. С использованием такого подхода были изучены протоонкогены c-fos, c-myc, c-src, антионкоген p53. В норме уровень экспрессии c-myc выше в пролиферирующих клетках, чем в дифференцирующихся. В присутствии антисмысловых олигонуклеотидов наблюдали понижение внутриклеточного уровня белка c-Myc в клетках линии HL60, что сопровождалось понижением скорости роста клеток и усилением миелоидной дифференцировки. Природные антисмысловые c-myc-РНК были обнаружены среди транскриптов клеток мышей. Антисмысловые c-fos -РНК предотвращали повторное вхождение покоящихся клеток 3Т3 (фаза G_o) в клеточный цикл.

Противовирусная терапия. Внутриклеточная экспрессия антисмысловых РНК, направленных против мРНК некоторых ключевых вирусных белков, может эффективно подавлять вирусную инфекцию. Этот результат был впервые получен с клетками E. coli, содержащими плазмиды, которые экспрессировали антисмысловые РНК, комплементарные различным участкам генов бактериофага SP. Бактериальные клетки приобретали иммунитет к фагу в наибольшей степени в том случае, если антисмысловые РНК были комплементарны 5’-концевым последовательностям мРНК (включая последовательности Шайна–Дальгарно) гена белка созревания. Менее эффективными оказались антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белков оболочки бактериофага или его репликазы. 15-Нуклеотидная антисмысловая последовательность, комплементарная сайту связывания рибосом мРНК, на 94% подавляла выход фага SP и оказывала значительный ингибирующий эффект на развитие родственных фагов Qb и GA. Эти опыты показали принципиальную возможность использования антисмысловых РНК для борьбы с вирусными инфекциями. Кроме того, высокая специфичность антисмысловых РНК по отношению к вирусным последовательностям нуклеотидов сводит к минимуму возможные цитотоксические и другие побочные действия. Современные методы генной инженерии позволяют вводить гены антисмысловых РНК в клетки зародышевой линии животных и растений, что может обеспечивать наследование этих генов в ряду поколений.

Обнадеживающие результаты были получены в опытах по ингибированию развития вируса саркомы Рауса (ВСР) в клетках перепелов. Антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белка оболочки ВСР, на 70–80% предотвращали внутриклеточное развитие ВСР, дефектного по белку оболочки, в присутствии плазмиды, экспрессирующей этот белок, которая без антисмысловой РНК комплементировала развитие дефектного вируса.

Были получены трансгенные растения табака, которые содержали экспрессирующий вектор, направляющий синтез антисмысловой РНК, комплементарной мРНК белка оболочки вируса мозаики огурцов (ВМО). Такие растения оказались устойчивыми к ВМО только при низкой множественности инфекции, а иммунитет к ВМО мог быть преодолен с помощью высоких концентраций инокулируемого вируса. Аналогичные результаты были получены с трансгенными растениями табака, экспрессирующими антисмысловые РНК, комплементарные транскрипту гена белка оболочки X. В этих опытах уровень экспрессии антисмысловых РНК оказался недостаточным для того, чтобы обеспечить полную устойчивость растений к вирусной инфекции, что требует дальнейшей оптимизации условий экспрессии генов антисмысловых РНК в клетках растений.