Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот

Пространственная организация репликативного синтеза ДНК у эукариот является одним из наиболее ярких примеров внутриядерной компартментализации генетических процессов. Анализ локализации мест синтеза ДНК в ядрах млекопитающих с использованием импульсной метки бромдезоксиуридина или биотинилированного dUTP обнаруживает всего ~150 мест включения этих предшественников (центров репликации), которые приблизительно равномерно удалены друг от друга. Во время инициации синтеза ДНК размер этих центров мал, и они обнаруживаются в виде небольших четко очерченных " точек", которые со временем становятся более диффузными. В данных центрах репликации происходит аккумуляция белков, участвующих в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы a, PCNA и RP-A, а также регуляторных молекул типа циклина А, cdk2 и RPA70. Иммунохимическими методами с использованием частиц коллоидного золота было показано, что растущие цепи ДНК выходят из центров репликации. Это позволяет предполагать, что во время репликативного синтеза цепи ДНК перемещаются через фиксированные внутри ядра структуры аппарата репликации. Такая внутриядерная компартментализация синтеза ДНК позволяет концентрировать регуляторные, структурные и ферментативные компоненты, участвующие в репликации и поддержании пространственной структуры хромосом. Ступенчатая сборка функционально активных элонгирующих комплексов в микрокомпартментах ядра предоставляет большие возможности для регуляции инициации репликативного синтеза ДНК.

Роль ядерных пространственных структур в обеспечении функциональных свойств ДНК можно рассмотреть на примере репликации хромосом в ооцитах Xenopus laevis. Инъекция прокариотической ДНК в ооциты или ее добавление к экстрактам ооцитов сопровождается образованием псевдоядер, компетентных в отношении репликации ДНК. Репликация в таких системах пространственно упорядочена: она происходит в дискретных участках ДНК, содержащих кластеры репликативных вилок. При этом наблюдается замечательная корреляция между числом и пространственным распределением центров репликации в искусственных псевдоядрах и ядрах культивируемых клеток, находящихся в S-фазе. Следовательно, сборка функционирующих комплексов, способных инициировать репликацию, не находится в строгой зависимости от последовательностей нуклеотидов ДНК хромосом, но в большой степени зависит от внутренней пространственной структуры ядра и может эффективно происходить даже на прокариотических ДНК. Это означает, что пространственная структура ядра может непосредственно контролировать его функции, в данном случае – инициацию репликации хромосом. Следует, однако, иметь в виду, что на ранних эмбриональных стадиях развития Xenopus контроль репликации ослаблен, и число зон начала репликации значительно больше, чем в соматических клетках. Нормальный контроль репликации устанавливается после увеличения продолжительности клеточного цикла на стадии средней бластулы.

В нормальных соматических клетках не все центры репликации одновременно начинают синтез ДНК. Некоторые из них функционируют в ранней, а некоторые в поздней S-фазе клеточного цикла. Такая дифференциальная репликация хромосом является важным регуляторным механизмом, обеспечивающим локальную организацию хроматина и активность генов. Аналогичное явление обнаружено в клетках дрожжей, где функционирование во времени центров репликации зависит от положения хромосом в ядре.