💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II

РНК не может находиться in vivo в свободном виде. На протяжении всего внутриклеточного существования – от инициации биосинтеза до полной деградации – РНК пребывает в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП). Интенсивные исследования РНП-частиц выявили множество белков, образующих такие комплексы. Поскольку почти все мРНК эукариот претерпевают одни и те же внутриклеточные превращения, основными из которых являются кэпирование, полиаденилирование и сплайсинг, в составе РНП обнаруживают ограниченный набор белков, обеспечивающих протекание этих процессов. Помимо белков, необходимых для специфической трансляции мРНК определенных видов, а следовательно, и ассоциированных только с этими видами мРНК, два белка представлены почти во всех цитоплазматических мРНП животных в больших количествах – уже обсуждавшийся выше поли(А)-связывающий белок PABP и белок р50. Роль последнего как универсального регулятора трансляции обсуждается в разделе 3.4. Здесь же будут рассмотрены другие, не менее универсальные белки мРНП, которые взаимодействуют с кэп-группами и обеспечивают сопряжение основных реакций посттранскрипционных модификаций мРНК эукариот и экспорта мРНП из ядра в цитоплазму.

Ядерный кэп-связывающий комплекс (CBC). Присоединение кэп-группы к любой строящейся цепи мРНК эукариот, что является ее первой (котранскрипционной) модификацией, оказывает глобальное влияние на все последующие реакции внутриклеточного метаболизма мРНК, включая ее трансляцию. Наличие кэп-группы дает возможность мРНК специфически взаимодействовать с белковым ядерным кэп-связывающим комплексом CBC (cap-binding complex). Очищенный до гомогенности CBC представляет собой гетеродимер белков CBP80 (молекулярная масса 80 кДа) и CBP20 (20 кДа). N-Концевая часть большой субъединицы CBC содержит сигнал ядерной локализации NLS (nuclear localization signal), обеспечивающий челночные функции CBC во время экспорта мРНП из ядра в цитоплазму (см. ниже). Для взаимодействия CBC с кэп-группой мРНК требуются обе его субъединицы, которые по отдельности не обладают кэп-связывающими свойствами. Обсуждаемые функции CBC сохраняются у всех исследованных видов эукариот – от дрожжей до человека.

Роль CBC в сплайсинге пре-мРНК. Уже более 15 лет известно, что кэп-структура m⁷G необходима для эффективного сплайсинга пре-мРНК в бесклеточных экстрактах клеток животных. Было установлено, что сплайсинг пре-мРНК с одним интроном подавляется в присутствии экзогенных аналогов кэпа или кэп-содержащих РНК. Резкое ингибирование сплайсинга наблюдали в экстрактах, истощенных с помощью специфических антител по большой субъединице CBC – CBP80. Дальнейшее всестороннее изучение этого явления показало, что гетеродимерный CBC требуется для эффективного сплайсинга кэпированных пре-мРНК.

Оказалось, что во время сплайсинга больших пре-мРНК кэп-группа оказывает влияние лишь на вырезание ближайшего к ней интрона. На рис. I.16 в схематически представлены результаты опытов, особенно четко демонстрирующих данное явление. В этих экспериментах использовали искусственные кэпированные пре-мРНК с двумя интронами, которые содержали один или несколько мутантных канонических сайтов сплайсинга в разных комбинациях. Инактивация 5'-концевого сайта сплайсинга первого интрона не оказывала влияния на вырезание второго интрона и блокировала вырезание первого (см. рис. I.16, в, 2). Мутация в ближайшем к кэп-группе 3'-концевом сайте сплайсинга сопровождалась вырезанием большой последовательности, включающей оба интрона и второй экзон, расположенный между ними (см. рис. I.16, в, 3). Такая конструкция процессировалась как пре-мРНК, содержащая только один интрон, вырезание которого зависело от наличия комплекса CBC. В том случае, если были инактивированы как 3'-, так и 5'-концевой сайты сплайсинга первого интрона, вырезание второго интрона происходило независимо от CBC (в истощенных по комплексу экстрактах) (не отражено на рисунке). Лишь одновременное разрушение 5'-концевого сайта сплайсинга и полипиримидиновой последовательности первого экзона сопровождалось появлением CBC-зависимости вырезания второго интрона (см. рис. I.16, в, 4). (Полипиримидиновая последовательность обсуждалась выше, в начале подраздела, посвященного сплайсингу.) Полученные данные показывают, что именно полипиримидиновая последовательность, а не 5'-концевой сайт сплайсинга первого экзона, обеспечивает кэп-независимое вырезание второго интрона. Принимая во внимание, что CBC необходим для эффективного взаимодействия U1-мяРНП с 5'-концевым сайтом сплайсинга ближайшего к нему интрона, высказывают предположение, что полипиримидиновая последовательность, расположенная перед центральным экзоном, выполняет аналогичные функции при определении этого экзона системой сплайсинга.

Сопряжение сплайсинга с формированием 3'-концевых последовательностей пре-мРНК. Для предшественников мРНК, не содержащих кэп-групп, характерна малая эффективность процессинга их 3'-концевых последовательностей в экстрактах ядер. Кроме того, в таких бесклеточных системах расщепление кэпированной пре-мРНК вблизи поли(А)-сайта подавляется аналогом кэп-группы m⁷GpppG и не происходит в экстрактах, истощенных по CBC с помощью антител. На основании такого рода данных делается вывод, что во время процессинга пре-мРНК CBC пространственно сближен с комплексом белков системы, формирующей 3'-концевые последовательности, и стабилизирует этот комплекс через белок–белковые взаимодействия, что необходимо для его эффективного функционирования. Пространственное сближение 5'- и 3'-концевых последовательностей было прямо продемонстрировано для РНП гигантских (35–40 т.о.) транскриптов колец Бальбиани.

В соответствии с современной моделью, поли(А)-сайт пре-мРНК участвует в определении ее последнего интрона вместо обычно используемого для этой цели 5'-концевого сайта сплайсинга. Недавно было установлено, что, в свою очередь, и 3'-концевой сайт сплайсинга последнего интрона стимулирует полиаденилирование пре-мРНК, а следовательно, и процесс удаления последнего интрона сопряжен с полиаденилированием предшественника.

Участие CBC в экспорте транскриптов РНК-полимеразы II из ядер в цитоплазму. Транскрипты РНК-полимеразы II разделяют, по крайней мере, на два больших класса: мРНК и U-мяРНК. Для РНК обоих классов характерно наличие кэп-групп, но малые ядерные РНК не полиаденилированы. Наличие кэп-группы резко стимулирует экспорт этих РНК из ядер в цитоплазму. С помощью иммуноэлектронной микроскопии удалось осуществить наблюдения in situза динамикой ассоциации, экспорта, а также диссоциации субъединиц CBC и транскриптов колец Бальбиани, которые представляют собой гигантские пуффы на политенных хромосомах слюнных желез комара Chironomus tentans. Проведение прямых наблюдений стало возможным благодаря большому размеру транскриптов колец Бальбиани (35–40 т.п.о.) и, как следствие, их пре-мРНП, в состав каждого из которых входит до 200 молекул белков. Было установлено, что белки CBC выходят из ядер в составе мРНП и повторно импортируются в ядра. При этом, в соответствии с современной моделью, происходит следующая последовательность реакций.

Как уже упоминалось, большая субъединица CBC CBP80 содержит специфическую аминокислотную последовательность – сигнал ядерной локализации (NLS). Гетеродимерный цитоплазматический рецептор этого сигнала животных состоит из двух субъединиц – импортина α (молекулярная масса 60 кДа) и импортина β (90 кДа). В цитоплазме импортин α взаимодействует непосредственно с NLS белков, импортируемых в ядро, и импортином β, который в, свою очередь, содержит сайт взаимодействия с ядерным поровым комплексом NPC (nuclear pore complex). Через NPC происходит обмен макромолекулами ядра и цитоплазмы. Белки, содержащие NLS, в комплексе с рецептором переносятся в ядро, где рецептор диссоциирует на субъединицы. Диссоциация рецептора на две субъединицы импортина в нуклеоплазме запускается особым ферментом, GTPазой Ran, связанной с GTP, сродство к которой импортина β выше, чем к импортину α. В результате импортин β удаляется из комплекса. В настоящее время не исключается возможность того, что диссоциировавшая субъединица импортина β остается связанной с цитоплазматической частью NPC. Механизм дальнейшей диссоциации импортина α и NLS не ясен. Полагают, что выход импортина β из комплекса ослабляет связь импортина α и NLS большинства ядерных белков, но не большой субъединицы CBC, с которой импортин α взаимодействует особенно прочно.

В ядре синтезированные РНК через кэп-группу взаимодействуют с CBC, находящимся в комплексе с импортином α, и через NPC перемещаются из ядра в цитоплазму. На цитоплазматической части NPC или в цитоплазме к комплексу CBC–РНК–импортин α присоединяется импортин β через импортин β -связывающий домен импортина α. Это облегчается тем, что в цитоплазме GTPаза Ran находится в комплексе с GDP из-за присутствия так называемого белка 1, активирующего GTPазу Ran (Ran GAP1), которая в его присутствии гидролизует связанный с ней GTP. Благодаря особым свойствам NLS кэп-связывающего комплекса CBC, присоединение импортина β в данном случае сопровождается диссоциацией РНК и белкового комплекса CBC-рецептор. В таком виде белковый комплекс переносится в нуклеоплазму, и цикл экспорта синтезированной РНК начинается сначала. В случае U–гяРНП такая цитоплазматическая диссоциация комплекса приводит к гиперметилированию кэп-группы гяРНК, сборке нового комплекса и реимпорту его вместе с гяРНК в ядро. Освобождение кэп-группы мРНК после ее выхода из ядра в цитоплазму делает возможным взаимодействие с ней фактора инициации трансляции eIF-4E с последующим вовлечением мРНК в синтез белка (см. раздел 2.5.1).

Участие CBC в сборке РНП-частиц и формировании правильной пространственной структуры мРНК. Большинство информации о сборке РНП-частиц и механизмах формирования пространственной структуры мРНК в цитоплазме получено с использованием транскриптов колец Бальбиани. Поэтому остается под сомнением возможность распространения выявленных закономерностей на другие транскрипты.

Сборка РНП-частиц осуществляется котранскрипционно (т.е. одновременно с транскрипцией) и начинается с 5'-конца растущей цепи РНК. Поскольку присоединение CBC к кэп-группе происходит одним из первых, полагают, что это инициирует упорядоченное взаимодействие с РНК других белков, входящих в состав гяРНП, с образованием РНП-фибриллы. Наличие кэп-группы дает возможность соответствующим механизмам функционально различать транскрипты РНК-полимераз I, II и III. Действительно, РНК, синтезируемые РНК-полимеразами I и III, не содержат на своих 5'-концах m⁷G-групп, включаются в РНП в составе других белков и не подвергаются сплайсингу и полиаденилированию. Для этих транскриптов характерны и другие механизмы транспорта из ядра в цитоплазму. Полагают, что набор белков, ассоциированных с РНК разных классов, определяется, прежде всего, особенностями их первичной структуры. В то же время белки РНП обеспечивают РНК пространственную структуру, оптимальную для ее дальнейшего внутриклеточного метаболизма и функционирования.