💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов

Общее число различных ДНК-геликаз даже у низших эукариотов гораздо больше чем у бактерий. Так, в геноме дрожжей S. cerevisiae около 200 открытых рамок считывания кодируют предполагаемые геликазы, которые могут выполнять самые разнообразные функции. Поэтому идентификация в таком большом наборе истинной «репликативной» ДНК-геликазы является очень трудной задачей. Можно ожидать a priori, что такая ДНК-геликаза должна быть функциональным аналогом белка DnaB E. coli, который не только принимает участие в инициации репликации хромосомы в области oriC (см. гл. 3), но и перманентно связан с реплисомой в хромосомных репликативных вилках (гл. 4).

В настоящее время считается, что такой эукариотической репликативной ДНК-геликазой является комплекс белков, названный МСМ (от m ini c hromosome m aintanance – сохранение минихромосом). Гены, кодирующие белки МСМ, были впервые идентифицированыв в дрожжей с использованием мутаций, нарушающих репликацию искусственных минихромосом и блокирующих движение по клеточному циклу. У S. cerevisiae обнаружены 6 таких генов (МСМ2-МСМ7), продукты которых абсолютно необходимы для инициации репликации. Сборка комплекса всех 6 белков на областях начала репликации является обязательным этапом инициации репликации (гл. 3). С другой стороны, анализ температурочувствительных мутантов по генам МСМ показал, что все 6 белков МСМ2-7 необходимы и в течение всей фазы S для элонгации репликации хромосом.

Дрожжевые белки MCM2-MCM7 высокогомологичны друг другу в центральной области длиной ~200 аминокислотных остатков (рис. 2.5). Она содержит элемент, похожий на мотив Уокера типа А (GXXGXGKS/T), в котором второй и третий остатки глицина заменены на сер или ала. Эта область отвечает за связывание НТФ. Белки МСМ2-7 можно отнести к суперсмейству АТФаз ААА+ (см. 1.4). У белков МСМ2, МСМ4, МСМ6 и МСМ7 имеется область, похожая на цинковый палец, с нетипичной структурой СХ₂СХ_18-19СХ_2-4С, которая, вероятно, участвует в белок-белковых взаимодействиях. Гомологи белков МСМ2-МСМ7 имеются у всех эукариотов. Для одноименных белков МСМ из разных организмов гомология не ограничивается центральным сегментом и заметна за его пределами.

Рис. 2.5. Сохранение структуры белков MСМ S. cerevisiae.

Черные сегменты – участки гомологии белков MСМ дрожжей с единственным белком MСМ архея Methanococcus thermoautotrophicum, цветные сегменты – участки гомологии субъединиц MСМ дрожжей с соответствующими белками млекопитающих.

Отмечено положение высоконсервативного домена связывания НТФ

У археев также имеются гомологи белков МСМ, необходимые для репликации. Некоторые археи (например, Methanococcus thermoautotrophicum), имеют единственный ген МСМ, что значительно облегчило изучение функции его продукта. Кодируемый этим геном белок образует двойные кольцевые гексамерные комплексы, обладающие ДНК-зависимой АТФазной и ДНК-геликазной активностью с полярностью 3’®5’. ДНК-геликаза МСМ этого архея высокопроцессивна и может расплетать in vitro дуплексы ДНК длиной до 500 п.н. Гомология архейной геликазы с белками МСМ2-7 эукариотов позволила предположить, что и комплекс МСМ обладает геликазной активностью.

Комплексы МСМ эукариотов действительно являются гексамерными и абсолютно необходимы для репликации ДНК на стадиях инициации и элонгации. Однако после выделения из эукариотических клеток такие комплексы имеют преимущественно не кольцевую, а глобулярную структуру, полностью лишены каталитических активностей и даже не связывают НТФ. С другой стороны, в процессе очистки образуются и тримерные субкомплексы Mcm4-Mcm6-Mcm7, которые спонтанно образуют кольцевые гексамерные структуры – предположительно, димеры тримеров 4-6-7. Такие структуры проявляют in vitro зависящее от АТФ связывание с онДНК, стимулируемую онДНК АТФазную активность и достоверную, но слабую ДНК-геликазную активность с полярностью 3’®5’, способную расплетать до 30 п.н. в дуплексах ДНК. Добавление к ним белка Mcm2 или димера Mcm3-Mcm5 вызывает разборку двойных тримеров и устраняет их геликазую активность. Это позволило предположить, что субъединицы Mcm4, Mcm6 и Mcm7 образуют каталитически активную сердцевину геликазы МСМ, а субъединицы Mcm2, Mcm3 и Mcm5 являются регуляторными субъединицами, негативно влияющими на геликазную активность. Таким образом, в отличие от других известных гексамерных ДНК-геликаз геликаза МСМ является гетероолигомерным белком, состоящим по меньшей мере из 3 разных субъединиц. Потребность в 6 белках МСМ даже на стадии элонгации позволяет предположить, что даже регуляторные субъединицы входят в гексамер не только во время инициации, но и во время движения репликативных вилок, но их ингибиторный эффнект сменяется активаторным. Активация всего комплекса, вероятно, зависит от посттрансляционной модификации регуляторных субъединиц на стадии инициации репликации, которую мы расссмотрим в гл. 3.

Рис. 2.6. Гипотетическая модель образования активных кольцевых гексамерных комплексов геликазы МСМ из разных субъединиц in vivo и in vitro

В качестве рабочей гипотезы для объяснения особенностей поведения комплекса МСМ предложена модель, преставленная на рис. 2.6. Согласно этой модели, природная геликаза МСМ собирается из двух неидентичных тримеров, один из которых состоит из каталитических субъединиц Mcm4, Mcm6 и Mcm7, а второй - из регуляторных субъединиц Mcm2, Mcm3 и Мcm6. После первичной сборки гетерогексамер МСМ организован в каталитически не активную глобулярную структуру. Посттрансляционная модификация регуляторных субъединиц на стадии инициации in vivo реогранизует этот комплекс в активное гексамерное кольцо, в котором регуляторные субъединицы чередуются с каталитическими. Это правильное взаимное расположение неактивных и активных субъединиц помогает каталитическим субъединицам образовать необходимую для геликазной активности кольцевую структуру с 3-кратной симметрией, изображенную на рис. 2.7 в виде треугольника. При выделении из клеток эта структура разрушается с освобождением регуляторных субъединиц и сборкой in vitro частично активных гексамеров из двух тримеров 4-6-7. В такой структуре одна триада Mcm4- Mcm6-Mcm7 участвует в каталитическом цикле ДНК-геликазы, а вторая заменяет, но недостаточно эффективно, структурную функцию отсутствующих модифицированных регуляторных субъединиц.