Методы количественного определения белка

В Государственной фармакопее XII издания опубликована статья «Определение белка» (ОФС 42-0053-07), в которой описано несколько групп методов количественного определения белка:

1. Спектрофотометрические методы, в которых измерение проводят при одной длине волны или при двух длинах волн. Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении светопоглощения растворов белков при 280 нм (поглощение ароматических аминокислот) или в области 205-220 нм (поглощение пептидных групп).

2. Колориметрические методы:

2.1 Метод с биуретовым реактивом. Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка. Для этого к небольшому объему испытуемого раствора добавляют биуретовый реактив, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем измеряют оптическую плотность раствора.

Чувствительность данного метода позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 2 до 10 мг в пробе.

2.2 Метод Лоури. Метод основан на биуретовой реакции белков с солями меди(II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм. Описано 2 разновидности данного метода - без предварительного осаждения белка (метод А) и с предварительным осаждением белка (метод Б). В методе А к испытуемому раствору сначала добавляют биуретовый реактив, далее фосфорномолибденово-вольфрамовый реактив, выдерживают при комнатной температуре 30 мин и измеряют оптическую плотность. Параллельно проводят подобное испытание со стандартным раствором белка.В методе Б предварительно для отделения осадка проводят центрифугирование.

Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет определять содержание белка в диапазоне концентраций от 10 до 100 мкг на пробу.

Многие широко используемые биохимические реагенты мешают количественному определению белка по методу Лоури, усиливая фон или нивелируя окраску с белком. К их числу относятся тирозин, триптофан, фенольные соединения, буферы (трис, хепес), сахара (сахароза, глюкоза), ЭДТА и другие.

2.3 Метод Бредфорда. Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90(компонент реактива Бредфорда) с белком при длине волны 595 нм. К испытуемому раствору, помещенному в пробирку, прибавляют реактив Бредфорда, перемешивают и измеряют оптическую плотность.

2.4 Метод с бицинхониновой кислотой. К испытуемому растворю добавляют реагент меди с бицинхониновой кислотой, выдерживают при 37°С в течение 30 мин, охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин измеряют оптическую плотность. Параллельно проводят подобное испытание со стандартным раствором белка.

3. Методы определения белка по содержанию азота:

3.1. Метод Къельдаля - титриметрический (А - микрометод, Б – обратное

титрование). Проводят в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях».

3.2. Метод с реактивом Несслера (колориметрический). Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера. Предварительно точную навеску лекарственного средства минерализуют по способу, описанному в микрометоде Къельдаля. Пробу после минерализации переносят в мерную колбу и доводят объем раствора до метки. Затем к небольшому объему полученного раствора добавляют реактив Несслера, перемешивают и через 15 мин на спектрофотометре измеряют оптическую плотность. Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом. Также описана модификация данного метода с использованием фосфорновольфрамовой кислоты.

4. Метод определения белка по аминокислотному составу.Метод включаеткислотный гидролиз белков до аминокислот, которые затем хроматографически разделяют в соответствии с инструкцией, прилагаемой к аминокислотному анализатору, и количественно определяют в сравнении со стандартами аминокислот.

Известны также спектрофотометрические методы количественного определения белка с использованием реактива Бенедикта, с красителем кумасси синим и метод Петерсона.[2]

Метод Петерсона аналогичен методу Лоури, однако в методе Петерсона используется буфер, в состав которого входит раствор додецилсульфата натрия. Данный метод характеризуется высокой чувствительностью (10-100 мкг белка), позволяет эффективно определять белок в мембранных фракциях.

Метод Бенедиктааналогичен биуретовому методу, но позволяет определять белок в диапазоне концентраций от 0, 1 до 2 мг в пробе.

На основе количественного определения белка с использованием красителя кумасси синего нами была разработана оригинальная методика количественного определения белковых веществ с красителем малахитовым зеленым.