Валидация методики спектрофотометрического определения альбумина в присутствии красителя малахитового зеленого

Для определения чистоты альбумина на данный момент используется метод спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях.

Добавление к исследуемой смеси раствора малахитового зеленого, имеющего аналогичный спектр поглощения в диапазоне 330 – 350 нм, увеличивает значение оптической плотности, что позволяет с большей точностью идентифицировать альбумин в различных лекарственных формах.

Объектом исследования стал раствор альбумина 10%, производимый на Челябинской станции переливания крови. В качестве стандартного образца использовали стандартный образец предприятия (СОП) альбумина с концентрацией 9, 33 %. Содержание белка в СОПе определяли по эталону методом Къельдаля. (Эталон стандартизирован и предоставлен Центральной лабораторией государственного контроля и изучения качества препаратов крови, кровезаменителей и консервирующих растворов).

Для приготовления модельных смесей расвтор альбумина 10 % в количестве 1мл помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в небольшом объеме воды, доводили этим же растворителем до метки. Аликвоты 1, 2, 3, 4, 5 мл помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляли водный раствор малахитового зеленого с концентрацией 0, 01 М, доводили общий объем раствора до 100 мл водой. Оптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волны 200 - 600 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали растворитель с теми же реактивами, что и испытуемый раствор.

Перед статистической обработкой данных была проведена проверка однородности выборок и установлено, что все они не содержат грубой ошибки, т.к. Q 1 < Q (n =6, Р=95%), т.е. Q 1 < 0, 56.

Валидацию разработанных методик проводили в соответствии с проектом ОФС 42-0113-09 «Валидация аналитических методик».

Специфичность методики определяли моделированием путем добавления в исследуемый компонент примесей – натрия хлорид (вспомогательное вещество), раствор иммуноглобулина 10%, сухой бычий альбумин. Проведено по 6 определений для стандартного образца и для исследуемых проб. В соответствии с полученными результатами установлено, что присутствие примесей вспомогательных веществ не мешает определению альбумина.

Линейность методики определяли путем измерения пяти проб с различной концентрацией определяемого вещества – разведения 1, 2, 3, 4, 5 мл до 100 мл. По полученным данным строили график зависимости сигнала как функции концентрации определяемого компонента, который отображен на рисунке 4. Визуально наблюдалась линейная зависимость, результаты обрабатывали методом наименьших квадратов. Аналитическая область методики находится в пределах линейной зависимости и описывается уравнением y=0, 0277*x + 0, 0069 с коэффициентом корреляции (R²) пределах тестируемого диапазона 0, 9956 (0, 7 £ |R| £ 1, 0).

Правильность предлагаемых методик определяли на 6 образцах модельных смесей с известным содержанием альбумина. Отклонение среднего результата определения от истинного значения определяемой характеристики не превысило доверительный интервал среднего определения. Соблюдается неравенство t выч < t табл (Р, f), следовательно, представленные результаты не отягощены систематической ошибкой и являются правильными.

С целью проверки повторяемости методик проводили четырехуровневый эксперимент по 3 опыта на каждом уровне. Первому уровню соответствует навеска – 0, 001, второму – 0, 002, третьему - 0, 003. Согласно данным t выч < t табл, что позволяет считать результаты выборки обеих методик свободными от систематической ошибки.

Сравнение вычисленного значения критерия Фишера (F выч.) с табличным значением (F табл.), найденном при Р=95%, удовлетворяет неравенству: F выч.> F табл. Соответственно, различие дисперсий s ²₁ и s ²₂ является статистически значимым, и методика дает воспроизводимые результаты.