Бумажная хроматография

Бумажная хроматография используется для идентификации компонентов смеси аминокислот с ди- и трипептидами, получаемой при частичном гидролизе белков и полипептидов.

Гидролиз может быть осуществлен кислотным, щелочным или ферментативным методом. Кислотный метод используется чаще (6 н. HCl, 8 н. H₂SO₄). Гидролиз проводят при нагревании, иногда при повышенном давлении. Показателями окончания гидролиза могут служить: прекращение нарастания карбоксильных или аминных групп в гидролизате, либо отрицательная биуретовая реакция. Избыток гидролизующего реагента удаляют: серную кислоту осаждают Ca(OH)₂, соляную кислоту отгоняют в вакууме, а остаток кислоты осаждают нитратом серебра.

Образцы наносят на бумагу в заранее отмеченную точку, отступив примерно 5 см от верхнего края полоски фильтровальной бумаги. Затем полоску подвешивают в закрытом сосуде, на дно которого налита смесь растворителей. Для разделения аминокислот используют полярные растворители в виде бинарных, тройных и более сложных смесей воды, спиртов, кислот и оснований. Более полярные компоненты растворителя ассоциируются с целлюлозой и образуют стационарную фазу, а менее полярные составляют подвижную фазу. Это нормальная распределительная хроматография. В распределительной хроматографии с обращенной фазой полярная и неполярная фазы меняются местами. Распределительная хроматография с обращенной фазой используется для разделения неполярных пептидов; для таких полярных соединений, как аминокислоты, она непригодна.

Растворитель перемещается по бумаге вверх или вниз (восходящая или нисходящая хроматография). Когда он доходит почти до конца, полоску вынимают из сосуда, высушивают и обрабатывают определенным образом, чтобы на ней проявились интересующие соединения (при разделении аминокислот используют обработку 0, 5%-ным нингидрином в ацетоне с последующим прогреванием в течение нескольких минут). Аминокислоты проявляются в виде окрашенных пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения возрастает с увеличением молекулярной массы. Для аминокислот с неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями (пролин, аланин, глицин) или с полярными боковыми цепями (треонин, аргини, цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических растворителях.