Дәріс: Өсімдік жасушаларын жасанды қоректік ортада өсіру әдістері.

Мазмұ ны

1.Дә рістер

2.Зертханалық сабақ тар

3.Емтихан сұ рақ тары

Дә рістер

Дә ріс: Кіріспе. Биотехнологияның мақ саты мен міндеттері.

1.Жасушаны жасанды ортада ө сіру.

2.Ө сімдіктер биотехнологиясының даму тарихы.

Биотехнология – экономикалық маң ызды заттар ө ндіру ү шін, ө сімдіктердің жаң а сорттарын, жануарлардың жаң а тү рлерін, микроорганизмдердің штаммаларын алу ү шін биологиялық процестер мен объектілерді пайдаланатын ғ ылым мен ө ндірістің жаң а саласы.

Биотехнологияның негізгі мақ саты - мә дени ө сімдіктердің жаң а сорттарын шығ аруғ а қ ажет селекциялық материалды аз уақ ыт ішінде алу ү шін ө сімдік жасушаларын ө сіру.

Сімдік клеткаларын қ олдан ө сіру дегеніміз ө сімдіктің жеке жасушаларын, ұ лпаларын, мү шелерін асептикалық жағ дайда жасанды қ оректік ортада ө сіру.

Ө сімдік ұ лпасының стерилденген кішкене бө лшегін Петри чашкасының немесе пробиканың ішіне агаризонды қ оректік ортағ а орналастырады. Содан кейін ұ лпада жасушалар белсенді тү рде бө ліне бастайды. Жасушалық тү зілім тез ө сіп каллус тү зеді. Каллус дегеніміз дифференцияланбағ ан жасушалардың жинақ талып ерекше ұ лпа тү зуі. Егер осы каллустың бө ліктерін балғ ын қ оректік ортағ а отырғ ызса, онда олар шектеусіз ө се алады.

«Ө сімдік жасушасын қ олдан ө сіру» термині ауқ ымды жә не ың ғ айлы ұ ғ ымғ а айналды, ол бө лініп алынғ ан жасушаны, ұ лпаны, мү шелерді, ұ рық ты жә не тұ тас ө сімдік-регенерантты қ олдан ө сіретін in vitro- ның барлық жұ мыстарын қ амтиды. In vitro термині (лат.- шыныда, ә йнекте) стерильді жасанды қ оршағ ан ортада ө тетін процестердің жағ дайларын сипаттау ү шін қ олданылады. In vivo (лат. – тіршілікте) организмнің тіршілік процестерінің табиғ и стерильді емес ортада ө туі. Ө сімдік-регенерант дегеніміз асептикалық тү рде алынғ ан, тамыры мен ө ркені мә дени ортада қ алыптасқ ан ө сімдік, демек in vitro.

Теориялық тү рде кез келген ө сімдік жасушасы ө зін бө ліп алғ ан организмге дейін дамуғ а потенциалды тү рде қ абілетті жә не ол белгілі бір жағ дайларда қ олдан ө сірілген. Бұ л қ асиет тотипатенттілік деп аталады. Тотипатенттілік (лат. totus – барлық, тұ тас, potential – кү ш) – тұ тас организмге дейін дамуын қ амтамасыз ететін ө зіне тә н генетикалық ақ паратты сақ тап, ү йлестіретін жасушаның қ асиеті. Ә детте, ә мбебап тотипатенттілік қ асиетке ө сімдіктің жә не жануардың ұ рық танғ ан жұ мыртқ а жасушасы ие. Ал сомалық жасушалардан тотипатенттілік қ асиетке тек қ ана ө сімдік жасушалары ғ ана ие, ә рі ол in vitro жағ дайында ғ ана. Қ олдан ө сірілетін жануарлар жасушасы тотипатенттілік қ асиеттен айырылғ ан.

XIX-XX ғ асырларда алғ аш рет неміс ғ алымдары ө сімдіктің бө лініп алынғ ан бө ліктері мен мү шелерін ө сіре бастады. 1883 жылы К.Рехингер бү ршіктерді, тамыр мен сабақ тың телімдерін ылғ алды қ ұ мда ө сіруге тырысқ ан. Ол кейбір тә жірибелерінен каллустың тү зілгенін байқ ағ ан, алайда қ орекпен қ амтамасыз етілмегендіктен жә не стерильді жағ дайлар сақ талмағ андық тан ұ зақ ө сетін ө сімдіктерді ала алмағ ан. Мұ ндай тә жірибелерді Х.Фехтингте жү ргізген.

1902 жылы Г.Габерланд жасушаларды қ олдан ө сіру принциптерін алғ аш рет нақ ты қ алыптастырды. Ол бірқ атар жабық тұ қ ымды ө сімдіктердің жапырағ ынан бө ліп алынғ ан паренхима жасушаларымен тә жірибе істеді жә не қ оректік орта ретінде сахароза, аспарагин, пептол қ осылғ ан Кноп ерітіндісін қ олданды. Г.Габерланд ө сімдіктің кез келген тірі жасушасы тотипатенттілік қ асиетке ие деген гипотезаны алғ а тартты жә не жалғ ыз бір жасушадан ұ лпа ө сіруге тырысты. Бірақ ол ө зінің керемет жаң алығ ын экспериментті тү рде дә лелдей алмады, ө йткені ол қ олайсыз объектілерді тандағ ан болатын: белсенді тү рде бө ліну мен эмбриональды ө су қ абілеттерін жоғ алтқ ан жің ішке дифференцияланғ ан арнайы жасушалар. Кейіннен белгілі болғ андай жас ұ лпалардың меристемалық жә не белсенді қ ызмет жасайтын жасушалары ғ ана қ олдан сә тті ө сіріледі.

Сонымен қ атар ө сімдік жасушаларын организмнен тыс ө сіру жануар объектілерімен айналысушы ғ алымдарды да қ ызық тыра бастады. Алғ аш рет жануардың бө лініп алынғ ан жасушасын ө сіру мү мкін екендігі дә лелденді. 1904-1907 жж Р.Харрисон бақ аның нейробластын лимфа сұ йық тығ ында ө сірді. Осыдан кейін жануарлардың жасушасын қ олдан ө сіру ә дістері жасала бастады, қ оректік орта ретінде лимфа, қ ан плазмасы, ұ рық сұ йық тығ ы пайдаланылды. Организмде жануарлар жасушасы қ анмен жә не лимфамен қ оректенеді, сондық тан оларды осындай қ оректік ортада ө сіру табиғ иғ а ұ қ сас болып келеді. Ал ө сімдік организмінің қ оректік заттарғ а бай болып келетін мұ ндай сұ йық ортасы жоқ, тіпті флоэма экссудатыда мұ ндай талаптарғ а сай келмейді.

Ботаниктер ө сімдіктердің бө лініп алынғ ан мү шелері мен бө ліктерін ө сіру ү шін қ олданғ ан қ оректік орталарының қ ұ рамы алғ ашында қ арапайым болды, қ оректік орталарының қ ұ рамы негізінен минералды тұ здардың қ осылыстарынан ғ ана тұ ратын. 1922 жылы бір мезгілде Германияда В.Котте мен АҚ Ш-та В.Роббинссон ө сімдік ұ лпаларын қ олдан ө сіру жетістігіне жетті. Олар меристемалық жасушалары бар ұ лпаларды қ олданды - бү ршіктер мен тамыр ұ штары. В.Котте жү гері мен бұ ршақ тың тамыр ұ штарын қ олдан сә тті ө сірді. Ол қ ұ рамында Кноп ерітіндісі, глюкоза, кейбір аминқ ышқ ылдары жә не пептон бар ә ртү рлі қ оректік орталарды қ олданды. В.Роббинсон жү герінің тамырын ө сіріп, қ оректік ортағ а ашытқ ы сығ ындысын қ осты. Алайда тамыр мынадай қ оректік ортада ұ зақ тіршілік етпеді. 10 жылдан кейін АҚ Ш-та Филипп Уайт В.Роббинсонның тә жірибесін қ айталады, бірақ ол қ ызанақ тың тамыр ұ штарын қ олданып, жақ сы нә тижелер алды.

Ф.Уайттың қ ызанақ тың тамыр ұ штарына жасағ ан тә жірибесі мен француз ғ алымы Роже Готренің шілік пен сә біздің камбий ұ лпаларына жасағ ан тә жібесі 30-шы жылдары ұ лпаларды қ олдан ө сірудің қ азіргі заманғ ы ә дістердің негізіне айналды. Ф.Уайт тамыр ұ штарын қ олдан ө сіру тә жірибесін 30 жыл бойы ү здіксіз жү ргізді, ал Р.Готре сә біз тамырының камбиі мен флоэмасынан каллусты клондар ө сірді. Ол қ оректік ортағ а ауксин қ осып жә не ауксиннің камбий жасушаларының бө лінуіне ә сер ететін қ абілеті бар екендігін кө рсетті Ф.Уайт пен Р.Готре ө сімдік ұ лпаларын қ олдан ө сірудің заманауи ә дістеріне ө те бағ алы жаң алық енгізді жә не осы уақ ыттан бастап ө сімдіктердің эксперименттік биологиясының жаң а бағ ыты белсенді тү рде дами бастайды. Кө птеген қ оректік орталардың қ ұ рамы жасалынды жә не макроэлементтердің, микроэлементтердің, витаминдердің, ө сімдіктердің ө суін реттеушілердің (кокос жаң ғ ағ ының, каштантың, жү герінің эндорспермдері, ашытқ ының гидролизты жә не т.б.) маң ызы зерттелді. Осы соң ғ ы кү рделі органикалық қ осылыстар бө лініп алынғ ан ұ лпаларғ а қ осылмаса жасушалардың бө лінуі мү мкін болмайды. Бұ л осы қ осылыстарда жасушалардың бө лінуін реттейтін фактор бар деген ойғ а ә келді.

Америкалық ғ алым Ф.Скуг қ ызметкерлерімен бірге темекі сабағ ының телімінде бү ршіктердің ө суін зерттеді жә не қ ұ рамында минералды тұ здары, кө мірсулары жә не витаминдері бар қ оректік ортағ а ө сірді. Каллустың тү зілуі, кейде бү ршіктердің қ алыптасуы байқ алғ ан. Қ оректік ортағ а ауксиннің қ осылуы бү ршіктердің ө суі мен қ алыптасуын тежеді. Ал ортағ а аденин керісінше бү ршіктердің қ алыптасуына ә сер етті жә не ол ауксиннің тежеушілік ә серіне бө гет жасады. Бұ л зерттеушілерді кокос сү тінің ө су факторында қ андай да бір пуриндік заттар бар деген ойғ а ә келді. Сондық тан олар алдымен нуклеин қ ышқ ылдарын зерттеуді бастайды. Содан кейін сельд спермасының ДНҚ -сы темекі жасушаларының бө лінуіне ә келетіні анық талады. Осы нә тижені ұ зақ уақ ыт бойы сақ талғ ан ДҚ Н-ның ескі препараты тапты – соғ ан қ арағ анда ө су факторы ДНҚ бұ зылуының ө німі болғ анғ а ұ қ сайды. Ф.Скуг пен оның қ ызметтестері темекі сабағ ының паренхима клеткаларының бө лінуіне жә не ауксиннің қ атысуымен бү ршіктердің дамуына ә сер ететін затты ашытқ ыдан бө ліп алды. Бұ л ө суді реттейтін затты олар кинетин деп атап, ал кинетин жататын ө суді қ амтамасыз етуші класты цитокининдер (жасушаның бө лінуін қ амтамасыз ететін заттар) деп атады. Осы жаң алық тың арқ асында Т.Мурасиге мен Ф.Скуг 1962 жылы темекі каллусының ө суіне қ ажет атақ ты қ оректік ортаның қ ұ рамын жасады. Бұ л қ оректік орта кө птеген ө сімдік тү рлерінің ә ртү рлі ұ лпалары мен мү шелерін қ олдан ө сіруге бірден бір лайық орта болып саналды жә не қ азіргі уақ ытта осы орта кең інен қ олданылады.

дә ріс: Ө сімдік жасушаларын жасанды қ оректік ортада ө сіру ә дістері.

1.Жасушаларды жасанды ортады ө сіру жағ дайлары.

2.Каллусты алу жә не оны жасанды ортада ө сіру.

3.Сұ йық ортада жасушаларды ө сіру.

Ө сімдіктердің жасушаларын, ұ лпаларын жә не мү шелерін қ олдан ө сіру сә тті шығ у ү шін жасанды ортаның қ ұ рамының жақ сы болуымен қ атар ә ртү рлі қ олайлы жағ дайлар жасалуы қ ажет. Осы айтылғ ан сө зге жасушаны қ олдан ө сіру сә тті болуы ү шін ү немі температура шамамен 25±2°С болуы қ ажет деп жалпылай қ абылданғ ан шешім дә лел болады. Алайда мұ ндай дә стү рлі тә сіл ақ параттың аздығ ынан қ олданылғ ан болатын. Ө йткені темекінің каллусының ө суіне 32°С, кә дімгі гармалағ а 30°С, ипомеяғ а 30-32°С қ ажет.

Температура ө сімдікте жү ретін метаболизм процестерінің бә ріне ә сер етеді. Температураны эксперименттің мақ сатына байланысты ә рбір объектіге жекелей лайық тыланып қ ойылуы керек. Бірақ мұ ндай тә жірибелерді жү ргізу ү лкен ең бек пен ұ зақ уақ ытты талап етеді, сондық тан ғ алымдар жасушаларды шамамен 25°С температурада ө сіре береді.

Жасушаларды қ олдан ө сіруге ә сер етуші сыртқ ы факторлардың бірі – жарық. Қ азіргі уақ ытқ а дейін фотоавтотрофтылық тек 16 ө сімдіктің тү ріне ғ ана тә н екені сипатталып жазылғ ан. Қ алғ андары фотоавтотрофтылық ө суге қ абілетсіз, оларды қ араң ғ ыда немесе ә лсіз тү скен жарық та ө сіреді. Хлорофилдерінен айырылғ ан ұ лпаларғ а жарық тың ә сер етуі фитохромды жү йемен қ амтамасыз етілген. Екіншілік қ осылыстарды алу ү шін қ олдан ө сірілетін жасушаны қ олданатын эксперименттерде жарық пен фотопериодтың белсенділігі мен сапасының ә сері нақ ты тағ айындалғ ан. Жасуша технологиясында жасушаларды жарық пен қ амтамасыз ету басты міндеттердің бірі.

Жасушаларды сә тті ө сіру ү шін қ ажет маң ызды факторлардың бірі – аэрация. Аэрациясыз ешбір жасуша тіршілік ете алмайды. Газдардың (оттегі, азот, кө мірқ ышқ ыл газы) жасушаларғ а ә сері мү лдем зерттелмеген.

Жасушаларды ө сіруде жә не жасанды ортасын жасағ анда физикалық фактор осмос қ ысымының да ә серін ескеру қ ажет.

Каллусты алу жә не оны қ олдан ө сіру.

Каллус – жасушаның қ алыптаспағ ан пролиферациясынан пайда болғ ан ұ лпа. Пролиферация – жасушаның жә не ұ лпаның бө лінуінен пайда болғ ан жаң а тү зілімдер. Каллус (лат. callus – тірі тері, мозоль) – ө сімдікте жарақ аттанудың нә тижесінде пайда болғ ан ұ лпаның ерекше тү рі. Ол жараның орнын қ орғ айды жә не қ оректік заттар жиналып арнайы қ орғ аныш қ абаты тү іледі немесе жараланғ ан мү ше қ айтадан қ алыптасады. Мұ ндай жасушалар ұ лпалар мен жасушаларды қ олдан ө сіру барысында да пайда болады. in vitro каллусының тү зілуі жә не ө суі ауксин мен цитокининмен реттеледі.

Каллусты алу жә не оның ары қ арай ө суі стерилбдікті талап етеді. Жақ сылап жуылғ ан ө сімдік материалы қ ұ рамында белсенді хлор (кальций мен натрий гипохлориті, хлорамин, хлорлы ә к), сынап (сулема, диоцид), сутегі диоксид, этанол бар ә ртү рлі заттармен стерилденеді. Осындай мақ сатта бромды, кү кірт қ ышқ ылын, фенолды жә не ерекше жағ дайларда антибиотиктерді сирек қ олданады. Стерилдеуші заттың тү рі, концентрациясы ә серт ету ұ зақ тығ ы стерилдеуге дайындағ ан ө сімдік объектісіне байланысты болады. Стерилдеуші зат барлық микроорганизмдерді жоятындай жә не ө сімдік ұ лпаларын минимальды жарақ аттайтындай ә сер етуі тиіс, сонда стерилдеуші зат дұ рыс таң далғ ан болып табылады. Сонымен қ атар стерилді зат сумен жуғ анда кетуі тиіс, ә йтпесе ұ лпалардың улану қ ауіпі туады да эксперименттің нә тижесіне кері ә сер етеді. Ә детте танымал стерилдеуші ә дістерді қ олданады немесе ә рбір объектіге экспериментті тү рде арнайы стерилдеу ә дісін жасайды. Қ олайлы стерилді қ оректік ортағ а орналастырылғ ан эксплант деп аталатын ұ лпаның немесе мү шенің фрагменті біраз уақ ыт ө ткеннен кейін ө се бастайды да каллус пайда болады. Бұ л процесс каллустың тү зілуі немесе каллусогенез деп аталады.

Сұ йық ортада жасушаларды қ олдан ө сіру.

Сұ йық ортада қ олдан ө сірілген ө сімдік жасушысын суспензионды культура деп атайды. Жасушаларды белгілі бір ө лшемде сақ тау ү шін оларды ә ртү рлі аппараттармен араластырып тұ рады. Жасушалардың аэрациямен қ амтамасыз етілуі ортаны араластырудың немесе шайқ алуының немесе сұ йық ортаның таза ауамен желдетуінің ә серінен болуы мү мкін. Жеке эксперименттерде жасушаларды инкубациялау ү немі қ оректік ортамен қ амтамасыз етіліп тұ рмайды, керісінше сұ йық ортамен жә не ауамен біртіндеп қ ана қ арым-қ атынас орнатады. Мұ ндай жағ дайда газ алмасу жақ сарады.

Суспензиядағ ы жасушаны агаризонды жазық тық та статистикалық тә сілмен ө сірілген жасушамен салыстырғ анда ерекшеліктері болады: жасуша популяциясы біртү рлі қ оректік ортада, аэрацияда болады; экзогенді факторлардың жасушалардың ө суіне жә не метаболизміне ә сер етуін оң ай бақ ылауғ а болады; олар биохимиялық жә не молекулалық -биологиялық зерттеулер жасауғ а қ олайлы болып келеді; олардан қ алыпты жасуша популяцияларын алу мү мкіндігі жоғ ары.

Суспензионды жасушаларды алу.

Ә детте суспензионды жасушаны алу ү шін каллусты ұ лпалар қ олданылады. Сұ йық ортағ а орналастырылғ ан эксплантты ө сімдікті алу мү мкін (мысалы, пыльниктерді). Экплант бетінде пайда болғ ан каллусты жасушалар бө ліне алады жә не ортағ а ө тіп суспезияның басталуына негіз болады. Бірақ бұ л ұ зақ ә рі нә тижесі тө мен процесс. Кейбір зерттеулер ү шін қ ажет жасушаларды ферментті мацерация тә сілімен алады, мысалы: жапырақ мезофилінен, бірақ мұ ндай суспензияны ұ зақ уақ ыт бойы сақ тап қ алу мү мкін емес.

Суспензионды жасушаларды алудың негізгі тә сілі тербелгіштегі сұ йық ортада борпылдақ дифференциалданбағ ан каллусты ө сіру болып табылады. Мұ ндай жағ дайда каллус жеке жасушаларғ а жә не жасушалық агрекаттарғ а оң ай ыдырайды. Борпылдақ каллусты арнайы осындай мақ саттар ү шін 2, 4-Д жә не қ ұ рамы азайғ ан немесе цитокинині жоқ ортада ө сіреді. Каллустың дезагрегациясына қ оректік ортада болмауыда жақ сы ә сер етеді, бірақ мұ ның салдарынан ө сімдік жасушаларын байланыстырушы негізгі материал – кальций пектинаты аз мө лшерде тү зіледі. Кальций пектинатын каллусқ а пектизамен ә сер ету арқ ылы бө ліп алуғ а болады.

Сұ йық ортадағ ы каллусты ұ лпалардың бө ліктері араластырудың ә серінен жасушаларғ а жә не жасушалық агрегаттарғ а ыдырап алғ ашқ ы суспензияны тү зеді. Каллустың ірі қ алдық тары мен ірі жасуша агрегаттарынан қ ұ тылу ү шін 1-2 қ абат марлы немесе нейлон қ олданып сү зеді немесе суспензияны тұ ндыру арқ ылы алады. Жасушалардың диссоциясына қ оректік ортаның қ ұ рамы, аэрация жә не суспензияны араластыруда ә сер етеді. Ешқ андай ә рекеттерге қ арамастан суспензия ешқ ашан жалғ ыз жасушалардан тұ ратын бір тү рде ғ ана болмайды.