Методы определения чувствительности к антибиотикам

Из-за формирования антибиотикоустойчивых популяций микроорганизмов с целью эффективного лечения необходимо предварительно определять чувствительность данного антибиотика к выделенной культуре возбудителя.

Основными методами определения антибиотикочувствительности бактерий in vitro является метод серийных разведений, диффузии в агар (бумажных дисков), определение способности к продукции бета- лактамазы, in vivo- на модели безмикробных животных, определение концентрации антибиотиков в крови и моче. Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. Диско-диффузный метод следует рассматривать как качественный. Методы разведения – более точные количественные способы исследования. Их применяют в особо важных практических случаях и научно-исследовательской работе.

Метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных различными антибиотиками в определенных концентрациях (зависят от терапевтической дозы и соотвествуют рекомендациям ВОЗ). Основан на использовании стандартных питательных сред, дисков и методов. Оценка результатов связана с существованием зависимости между размером зоны подавления роста исследуемых культур вокруг дисков и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков (чувствительностью микроорганизмов). Имеются специальные таблицы для оценки результатов, в соответствии с которыми культуры определяют как чувствительные, умеренно устойчивые и устойчивые (резистентные) к тестируемому антибиотику.

Для исследования можно использовать стандартные питательные среды: отечественные среды АГВ №1, №2 и зарубежные – Мюллер-Хинтон агар.

На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1мл исследуемой культуры (18-20 часовой бульонной культуры или стомиллионной суспензии из агаровой культуры., равномерно распределяют путем покачивания чашки и удаляют если необходимо избыток пипеткой. После посева чашки подсушивают при комнатной температуре 10-15 мин. Диски с антибиотиками накладывают пинцетом на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки (на одну чашку не более 6 дисков). Чашки сразу ставят в термостат вверх дном и инкубируют при 37⁰С в течение 18-20 ч (время инкубации зависит от вида исследуемого микроорганизма. Для учета результатов чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность и освещают настольной лампой под углом 45⁰. Допускается учет в проходящем свете. С помощью линейки измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков, с точностью до 1мм. Оценку результатов проводят по таблице. В медицинской практике обычно определяют 3 группы микроорганизмов по чувствительности к антибиотикам: чувствительные, среднечувствительные и устойчивые. «Чувствительные» микроорганизмы, когда обычно применяемые дозы антибиотика могут обеспечить лечебный эффект. «Среднечувствительные» микроорганизмы – повышенные дозы антибиотика могут обеспечить лечебный эффеки. «Устойчивые» микроорганизмы – нельзя рассчитывать на лечебный эффект.

Метод серийных разведений антибиотиков позволяет более точно определить МПК, однако из-за громоздкости применяется реже.

Для исследования используют мясопептонный бульон. Основные растворы антибиотиков приготавливают путем взвешивания их порошка и растворения его в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить определенную удобную концентрацию. Разведения антибиотиков готовят путем разбавления основного раствора антибиотика бульоном. Для этого используют 11 пробирок. В первую пробирку вносят 2 мл раствора антибиотика и переносят по 1 мл раствора антибиотика из первой пробирки в каждую последующую. Затем суточную бульонную культуру разводят до 10⁵ – 10⁶ микробных тел в 1 мл и вносят по 1 мл во все пробирки с разведениями антибиотика. Посевы инкубируют при 37⁰С. Отмечают первую пробирку с задержкой роста микробов.

Бета- лактамазный тест (определение способности к образованию бета- лактамаз) чаще определяют методом дисков с нитроцефином - цефалоспорином, изменяющим окраску дисков при гидролизе. Положительный тест свидетельствует о резистентности бактерий ко всем бета- лактамаза- чувствительным пенициллинам.

Ускоренные методы определения чувствительности.

Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами микробиологических исследований. В кюветах панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками. Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации, соответствующей критерию принадлежности бактерий к группе «чувствительных» к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-370С в течение 4-5 часов. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле без антибиотика.