Методы клонирования и получения рекомбинантной ДНК

В генной инженерии молекулярное клонирование определяют как способ создания рекомбинантных ДНК, основанный на встраивании кодирующих нуклеотидных последовательностей (генов, кДНК, регуляторных элементов) в самореплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК (вектора) с использованием модифицирующих ферментов. Вектором называют искусственно созданную кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к репликации в бактериальной клетке и служащую для доставки того или иного гена в клетку

Рис. Регуляторные элементы типичного вектора. Как видно на рисунке, в состав вектора входят такие регуляторные элементы, как промотор, ген устойчивости к антибиотику, точка начала репликации (ориджин) и сайт множественного клонирования, куда встраивают кодирующую последовательность.

Вектор обязательно содержит такие регуляторные элементы, как точка начала репликации (для само-репликации), промотор для транскрипции и/или экспрессии белка, сайт множественного клонирования (для встраивания нуклеотидных последовательностей) и селективный маркер, с помощью которого можно отобрать клетки, содержащие вектор, (например, ген устойчивости к антибиотику). Существуют два типа векторов: экспрессионные и неэкспрессионные (или как их называют транскрипционные). Экспрессионные вектора обеспечивают экспрессию встроенного гена в клетке, а основная функция транскрипционных векторов заключается в наработке больших количеств встроенной нуклеотидной последовательности. По количеству копий, которые вектора образуют при репликации, их подразделяют на низкокопийные или высококопийные. Векторы, использующиеся для генно-инженерных манипуляций в случае бактериальных или дрожжевых клеток, называют плазмидами.

Основными инструментами для генно-инженерных манипуляций являются ДНК-модифицирующие ферменты. Наиболее часто используют рестриктазы (ферменты, специфически расщепляющие двуцепочечную ДНК), ДНК - лигазы (ферменты, «сшивающие» концы двуцепочечной ДНК) и ДНК - полимеразы (ферменты, синтезирующие и амплифицирующие ДНК). Кроме этого, для реализации специфических задач применяют обратные транскриптазы (ферменты, синтезирующие ДНК на основе мРНК), фосфатазы (ферменты, дефосфорилирующие ДНК) и нуклеазы (ферменты, расщепляющие одноцепочечную ДНК).

Общая стратегия молекулярного клонирования включает в себя: 1)амплификацию интересующей нуклеотидной последовательности гена или кДНК, 2) ее специфическую рестрикцию, а также рестрикцию вектора, 3) сшивку полученных фрагментов под действием лигазы, 4)трансформацию полученной лигазной смеси в клетки E.coli и 5) анализ полученных после трансформации колоний и отбор правильных вариантов.