Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Реактивы и оборудование:

- стеклянная коническая колба для приготовления агарозы. В случае электрофореза РНК колбу следует предварительно проавтоклавировать.

- прибор для агарозного гель-электрофореза. В случае электрофореза РНК все составные части прибора следует промыть по следующей технологии: 1) Промыть камеру и крышку от прибора для электрофореза, а также заливочный столик, планшет и гребенку водой в присутствии детергента (например, Fairy), 2) Протереть все спиртом, 3) Протереть все 3% раствором H₂O₂ в воде, 4) Залить камеру, крышку 50 мМ NaOH, смочить заливочный столик, а гребенку и заливочную рамку поместить в камеру. Через 10 минут инкубации слить NaOH и промыть все бидистиллированной водой

- УФ - трансиллюминатор.

- агароза

- TAE-буфер или TBE буфер. Состав 50-кратного TAE: 242 г триса, 57.1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0.5 М ЭДТА pH 8.0 растворить в 1 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. Состав 10-кратного TBE: 545 г триса, 278 г борной кислоты, 46.5 г ЭДТА растворить в 5 л дистиллированной воды. Перед использованием развести до однократного раствора. В случае проведения электрофореза РНК раствор следует проавтоклавировать и обработать DEPC или тиол-содержащими соединениями.

- буфер для образцов.

В случае электрофореза ДНК состав 6-кратного буфера для образцов: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.15% orange G, 0.03% ксиленцианол, 0.125% бромфеноловый синий, 60% глицерол, 60 mM ЭДТА. В случае электрофореза РНК состав 2-кратного буфера для образцов: 95% формамид, 0.025% SDS, 0.025% бромфеноловый синий, 0.025% ксилен цианол, 0.025% бромистый этидий, 0.5 mM EDTA.

- набор фрагментов ДНК или РНК стандартной длины (например, 1 kb DNA ladder или RNA ladder (Fermentas))

- краситель: бромистый этидий (раствор 10 мг/мл, хранить в темноте) либо SYBR green I (обычно 10000-кратный, хранить при -20°С, также в темноте).

Ход работы:

Взвесить необходимое для приготовления геля количество агарозы (в зависимости от процентности геля и количества приготовляемого раствора), перенести ее в стеклянную колбу и добавить необходимый объем ТАЕ- или TBE- буфера. Полученную суспензию прогреть в микроволновой печи до полного расплавления агарозы. Необходимо внимательно следить за процессом, так как агароза быстро выкипает, а также несколько раз останавливать прогрев и перемешивать содержимое колбы. В случае электрофореза РНК необходимо для взвешивания использовать стерильный шпатель.

В случае, если в качестве детектирующего агента используется бромистый этидий, в готовую «расплавленную» агарозу добавить бромистый этидий из расчета 0.5 мкг/мл геля. Если окрашивать гель планируется SYBR green I, то после окончания электрофореза следует погрузить гель в раствор SYBR green I на TAE-буфере (разведение 1: 10000) и инкубировать при перемешивании 1 час при комнатной температуре.

Собрать заливочный столик, и аккуратно залить в него расплавленную агарозу и сразу же вставить гребенку. Объем вносимой агарозы определяется размером лунок и количеством исследуемого образца, который будет внесен. Гель оставить застывать при комнатной температуре Из заливочного столика аккуратно вынуть рамку с гелем и вставить ее в камеру для проведения электрофореза. В камеру залить буфер ТАЕ так, чтобы он покрывал поверхность геля. Осторожно вынуть гребенку под буфером, чтобы не повредить лунки.

На фрагменте парафильма или в эппендорфах (в зависимости от объема образцов) смешать исследуемый образец ДНК с 6-кратным буфером для образцов или образец РНК с 2-кратным буфером для образцов и аккуратно нанести в лунку под лампой, не повреждая саму лунку. В случае РНК-электрофореза образец следует прогреть при 70  С в течение 10 минут, чтобы денатурировать вторичную структуру РНК. В качестве контроля сравнения нанести набор фрагментов ДНК или РНК различной длины, уже содержащий красители.

Закрыть камеру крышкой и проводить электрофорез при напряжении 6-8V/см длины геля.

После окончания электрофореза визуализировать фрагменты ДНК или РНК с помощью УФ-трансиллюминатора (ультрафиолетовой лампы) при 300 нм и сфотографировать полученное изображение.

Препаративный электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля.

Препаративный ДНК-электрофорез проводят так же, как и аналитический электрофорез, но с некоторыми модификациями. Для лучшего разделения фрагментов ДНК такой электрофорез проводят при более низком напряжении обычно 5-6 V/см. При этом гель меньше нагревается, что улучшает разрешение каждого фрагмента ДНК и снижает скорость диффузии. При использовании одного геля для препаративного электрофореза и экстракции нескольких различных образцов ДНК, образцы наносят через лунку, чтобы избежать загрязнения одного образца другим. Препаративный электрофорез проводят только в свежем TAE-буфере

После прохождения препаративного электрофореза фрагменты ДНК визуализируют с помощью UV-трансиллюминатора при длине волны 354 нм (слабый ультрафиолет), чтобы минимизировать возникновение мутаций в ДНК, которая будет впоследствии экстрагирована. С помощью скальпеля аккуратно вырезают фрагмент геля, содержащий интересующий фрагмент и переносят его в эппендорф.

Дальнейшая процедура экстракции фрагмента ДНК проходит по протоколу компании на колонках, носитель в которых идентичен колонкам, используемым в выделении плазмидной ДНК. Некоторые растворы, используемые для экстракции фрагментов ДНК из геля, идентичны растворам, используемым в выделении плазмиды. Общий принцип экстракции фрагментов из геля заключается в растворении фрагментов геля вместе с ДНК в специальном буфере и очистке фрагмента ДНК от растворенной агарозы на колонке методом ионообменной хроматографии.