💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

Прокариотические системы

Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения, могут быть применены и для других бактериальных клеток. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К⁺ или NH₄⁺) и двухвалентные (Mg²⁺ или Са²⁺) катионы, а также буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах.

Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗО-экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.

В том случае, если разрушение бактериальных клеток проводят жесткими методами с применением ультразвука, растирания со стеклянными бусами и т.п., освобождение от эндогенных нуклеиновых кислот становится сложной задачей и требует фракционирования экстрактов с помощью ионообменной хроматографии. При такой хроматографической очистке фракции S1OO из нее удаляются все аминоацилированные и свободные молекулы тРНК. Поэтому при реконструировании бесклеточной белоксинтезирующей системы к объединенным фракциям рибосом и S1OO-экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.

Экстракты бактериальных клеток S30 и S1OO, кроме всех необходимых факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы транскрипции, включая РНК-полимеразу, фактор терминации транскрипции r, CRP-белок и т.п. Поэтому для создания ДНК-зависимой системы сопряженной транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов, находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов, как правило, не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы в ней начала активно синтезироваться мРНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге в таких бесклеточных системах в ряде случаев удается синтезировать высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью.

Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений в бесклеточных системах часто используют экстракты мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п.

Не существует больших ограничений на первичную структуру мРНК, транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие совершенной вторичной структуры или каких-либо особо прочных кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых мРНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы.

GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая, в свою очередь, регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и СТР.

Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия. Наиболее существенным фактором в этом случае является концентрация ионов Mg²⁺. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg²⁺ в системе на 1–2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. При этом влияние ионов Mg²⁺ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg²⁺. В системах in vitro ионы Mg²⁺ могут быть заменены на ионы Са²⁺ и даже Мn²⁺, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.

Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K⁺ или NH₄⁺, оптимальные концентрации которых составляют ~100 мМ. Ионы Na⁺ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl^-. Ионы Mg²⁺, К⁺ и NH₄⁺ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме, а также обеспечения других их функций.

Несмотря на то что в бесклеточной трансляции чаще всего находят применение системы с использованием SЗО- и S1OO-экстрактов с добавленными рибосомами, современный уровень знаний молекулярных механизмов трансляции позволяет получать бесклеточные белоксинтезирующие системы из полностью очищенных компонентов. Однако создание таких систем является трудоемким процессом, поэтому их применяют только в аналитическом варианте для решения специальных задач.