Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)

💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

Эта линия клеток и ее многочисленные производные часто используются для синтеза рекомбинантных белков после предварительной эндогенной амплификации соответствующих рекомбинантных генов, введенных в клетки с помощью трансфекции. Спонтанная амплификация генов в нормальных клетках животных является редким событием, а в трансформированных (опухолевых) клетках она происходит с частотой 10^-4–10^-6 за клеточную генерацию. Частота амплификации определенных генов может быть повышена в результате некоторых экзогенных воздействий, включая инкубацию клеток с гидроксимочевиной, афидиколином, канцерогенами, а также под действием ультрафиолетового света или g-излучения и в условиях гипоксии. Амплификация гена обычно начинается с его вырезания из хромосомы в составе протяженного сегмента ДНК, сопровождаемого образованием кольцевой структуры, которая продолжает существовать в виде внехромосомного элемента (двойной минихромосомы (double-minutes – DM)), способного к автономной репликации. Предполагают, что DM является промежуточным продуктом амплификации, образующимся в условиях низкого давления селектирующего фактора окружающей среды. На более поздних стадиях амплифицирующаяся ДНК после повторной интеграции в геном обнаруживается преимущественно в составе удлиненного участка хромосомы (extended chromosomal region – ECR), иначе называемого гомогенно окрашивающейся областью (homogeneously staining region – HSR). На этой стадии амплифицированный участок генома клеток, а следовательно, и их фенотип становятся более стабильными.

Для биотехнологических целей в системе амплификации рекомбинантных генов в качестве селектируемого маркера часто используют ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР), интегрированный в экспрессирующий вектор. ДГФР катализирует превращение фолиевой кислоты в тетрагидрофолат, необходимый для синтеза эукариотическими клетками глицина, тимидинмонофосфата и пуриновых оснований. В этой связи клетки CHO, в которых ген ДГФР инактивирован под действием мутации, не растут на средах без нуклеозидов и приобретают эту способность после трансфекции геном ДГФР. Растущие трансфектанты далее отбираются по признаку амплификации гена ДГФР на фоне увеличивающихся концентраций метотрексата – ингибитора ДГФР, в питательной среде, так как увеличение числа копий гена будет придавать клеткам устойчивость к ингибитору в больших концентрациях. После проведения множественных раундов селекции получают популяцию клеток, содержащих до нескольких сотен копий гена ДГФР.

Рис. II.13. Кассеты генов в экспрессирующих векторах, использованные для получения фактора, ингибирующего лейкозы, в культурах клеток

а – кДНК huLIF (черные стрелки), включающая лидерные последовательности (незаштрихованные прямоугольники), была интегрирована в экспрессирующий вектор pXMT3 под контроль гибридного промотора, расположенного между точкой начала репликации вируса SV40 и основным поздним промотором аденовируса (SV40/AdMLP), ДГФР, amp, neo – гены дигидрофолатредуктазы и устойчивости к ампициллину и неомицину соответственно, VA – трансляционный энхансер; pA – сайт полиаденилирования;

б – вектор pSV2neo-Ig-huLIF, сконструированный на основе транскрипционных и трансляционных регуляторных элементов генов тяжелой (IgH) и легкой (IgL) цепей иммуноглобулинов. Транскрипция кассеты контролируется мышиным промотором гена IgL k и энхансером гена IgH. Транскрипт, содержащий последовательность huLIF, в результате сплайсинга объединяется с экзоном 2 гена IgL, кодирующего лидерную последовательность, которая обеспечивает секрецию зрелого huLIF клетками;

в – вектор pGES-LIF, прямоугольники 1–4 – регуляторная область кластера глобиновых генов, короткая черная стрелка – промотор b-глобинового гена, ломаной линией отмечены последовательности, удаляемые сплайсингом. Во всех случаях стрелки указывают направление транскрипции

Размер амплифицированного геномного локуса значительно больше размера селектируемого гена и может составлять несколько сотен тысяч пар оснований. Трансфекция клеток геном ДГФР и исследуемым рекомбинантным геном, заключенными в один экспрессирующий вектор, сопровождаемая их интеграцией в геном, будет приводить к их совместной амплификации на фоне метотрексата и усилению синтеза требуемого рекомбинантного белка, как следствие увеличения дозы его гена. Данные о возможности сохранения высокого уровня экспрессии гена в отсутствие селектирующего агента, т.е. генетической стабильности продуцентов, противоречивы. Результат зависит от генотипа конкретных клонов клеток, в том числе и локализации сайта интеграции экспрессирующего вектора в геном клеток CHO. Эффективным экспрессирующим вектором, используемым в описываемой системе, является двухцистронная молекула ДНК, в которой исследуемый рекомбинантный ген находится под контролем сильного промотора перед геном ДГФР, что обеспечивает высокое сопряжение синтеза рекомбинантного белка с уровнем устойчивости клеток к метотрексату (рис. II.13, а).

Клетки миеломы находят широкое применение для получения гибридом – линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции. Кроме того, такие клетки способны расти в суспензионной культуре (без прикрепления к поверхности субстрата), что облегчает их культивирование при необходимости крупномасштабной наработки.

Линия клеток мышиной миеломы Sp2/0 Ag14, утративших способность синтезировать или секретировать иммуноглобулины, часто используется для производства рекомбинантных белков. Клетки этой линии легко трансфецируемы рекомбинантными ДНК и могут выращиваться в больших количествах на питательной среде без дорогостоящей сыворотки. Клетки Sp2/0 экспрессируют эндогенный ген ДГФР, что делает невозможным их прямое применение для амплификации рекомбинантных ДНК с использованием метотрексата. Это затруднение обычно преодолевают путем введения в экспрессирующий вектор мутантного гена ДГФР, в котором точковая мутация, сопровождаемая заменой T®G, приводит к замещению Leu®Arg в положении 22 полипептидной цепи ДГФР, следствием чего является понижение сродства фермента к метотрексату в 270 раз. Благодаря этому после трансфекции может быть проведен отбор клеток, содержащих мутантный ген ДГФР вместо нормального, путем постепенного увеличения концентрации метотрексата в среде. При умеренных концентрациях ингибитора эндогенный ген ДГФР полностью инактивируется, тогда как мутантный ген остается активным и может быть амплифицирован в результате описанного выше механизма после повышения концентрации метотрексата в среде. Однако уровень амплификации гена ДГФР и ассоциированного с ним рекомбинантного гена в такой системе как правило ниже, чем в обычной, так как меньшее число внутриклеточных копий мутантного гена требуется для обеспечения необходимого уровня устойчивости клеток к ингибитору. Кроме того, было показано, что высокий уровень внутриклеточной экспрессии рекомбинантных генов, введенных в клетки Sp2/0 с помощью трансфекции, может обеспечиваться после инкубации с метотрексатом за счет увеличения скорости их транскрипции, а не в результате их амплификации. Такой результат может быть получен в результате введения множественных копий гена ДГФР при трансфекции. Структура одного из векторов, пригодного для использования с миеломными клетками Sp2/0, представлена на рис. II.13, б). Транскрипция трансгенов в этом векторе обеспечивается промоторно–энхансерными элементами гена иммуноглобулина с участием эндогенных регуляторных факторов клеток миеломы.