💸 Как сделать бизнес проще, а карман толще?

Тот, кто работает в сфере услуг, знает — без ведения записи клиентов никуда. Мало того, что нужно видеть свое раписание, но и напоминать клиентам о визитах тоже. Проблема в том, что средняя цена по рынку за такой сервис — 800 руб/мес или почти 15 000 руб за год. И это минимальный функционал. Нашли самый бюджетный и оптимальный вариант: сервис VisitTime.
⚡️ Для новых пользователей первый месяц бесплатно. А далее 290 руб/мес, это в 3 раза дешевле аналогов. За эту цену доступен весь функционал: напоминание о визитах, чаевые, предоплаты, общение с клиентами, переносы записей и так далее.
✅ Уйма гибких настроек, которые помогут вам зарабатывать больше и забыть про чувство «что-то мне нужно было сделать».
Сомневаетесь? нажмите на текст, запустите чат-бота и убедитесь во всем сами!

SOS-мутагенез у бактерий

Образование мутаций в клетках организма, подвергнутого мутагенному воздействию, происходит в основном по одному и тому же механизму. При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или ошибочно кодирующий поврежденный участок ДНК наблюдается включение в синтезируемую цепь случайных или соответствующих мутантному участку нуклеотидов. Затем репликация ДНК продолжается в обычном режиме. Таким образом, природа первичных повреждений матричной ДНК определяет тип мутационных замен нуклеотидов в ДНК.

У E. coli мутагенез под действием УФ-света и многих химических веществ происходит в результате координированной экспрессии большого числа генов, индуцируемых в ответ на повреждение ДНК. Такая реакция бактериальных клеток на генотоксические воздействия получила название SOS-ответа, а сам процесс образования мутаций – SOS-мутагенеза. В индукции SOS-ответа у E. coli определяющую роль играют два гена: lexA и recA. Белок LexA является репрессором гена recA и более 20 других генов и оперонов, составляющих SOS-регулон. В ответ на повреждение ДНК или ингибирование репликации, как правило, при прохождении ДНК-полимеразой поврежденного участка ДНК вырабатывается внутриклеточный SOS-сигнал. При этом продукт гена recA связывается с одноцепочечными участками ДНК и в результате конформационного перехода обратимо превращается в активированную форму RecA*. Молекулы белка LexA диффундируют к RecA* и взаимодействуют с ним, что сопровождается протеолитическим расщеплением LexA вблизи середины его полипептидной цепи (связь Ala-84-Gly-85), что инактивирует LexA как репрессор. В результате происходит индукция LexA-зависимых генов SOS-регулона. В этой реакции белок RecA* не действует как протеиназа, но активирует криптическую протеиназную активность LexA, что завершается расщеплением полипептидной цепи репрессора по аутокаталитическому механизму.

Исследование мутантов E. coli, неспособных к SOS-ответу при УФ-повреждениях, привело к открытию еще одного ключевого локуса umuC. Оказалось, что этот локус является опероном, состоящим из двух генов – umuD и umuC. Потеря функции любого из данных генов приводит к подавлению SOS-ответа мутантных бактерий. Таким образом, umuCD -оперон, находящийся под контролем репрессора LexA, входит в состав SOS-регулона, и его функционирование абсолютно необходимо для SOS-мутагенеза. Во время SOS-ответа белок UmuD также расщепляется по аутокаталитическому механизму, запускаемому RecA*. Образующийся в результате полипептид UmuD’ с молекулярной массой 12 кДа, включающий С-концевые остатки UmuD, оказался одним из самых важных компонентов системы SOS-ответа и SOS-мутагенеза у E. coli. Исследования различных мутантных производных UmuD показали, что его нативная форма не является просто неактивным предшественником белка UmuD’, а выполняет функции репрессора SOS-ответа. В растворе UmuD и UmuD’ существуют как в виде гомодимеров, так и более стабильного гетеродимера UmuD–UmuD’, каждый из которых может объединяться с белком UmuС. Комплекс (UmuD’)₂–UmuC запускает SOS-ответ, тогда как тримеры (UmuD)₂–UmuC и UmuD–UmuD’–UmuC являются в этом отношении неактивными. Образование последнего гетеротримерного комплекса играет важную роль в прекращении клеткой SOS-ответа, так как в этом случае активные внутриклеточные UmuD’ и UmuC выводятся из реакции.

Белок RecA, кроме двух вышеупомянутых функций в индукции аутокаталитического расщепления LexA и UmuD, выполняет и третью функцию в SOS-ответе: участвует в формировании так называемых нуклеиново-белковых филаментов в местах одноцепочечных брешей на поврежденной ДНК. С этими филаментами могут соединяться белки UmuD’ и UmuC в составе активного комплекса. Предполагают, что в результате такого взаимодействия комплекс (UmuD’)₂–UmuC осуществляет переключение репаративного синтеза ДНК с нужд гомологичной рекомбинации на SOS-мутагенез. Среди других белковых компонентов системы SOS-мутагенеза E. coli необходимо отметить холофермент ДНК-полимеразы III, который проводит включение нуклеотидов в строящуюся цепь ДНК на поврежденном участке. Кроме того, для нормального функционирования системы SOS-мутагенеза необходимы продукты генов groEL и groES, являющиеся молекулярными шаперонами. Их роль, как полагают, сводится к стабилизации и обеспечению правильного фолдинга белка UmuC.

Таким образом, синтез ДНК на поврежденном участке требует наличия белков UmuD’, UmuC, RecA и холофермента ДНК-полимеразы III. Это было окончательно подтверждено при использовании бесклеточной системы, содержащей все вышеупомянутые белки, а также фрагмент одноцепочечной ДНК с единственным мутантным сайтом без одного азотистого основания. Способность ДНК-полимеразы III преодолевать поврежденный участок ДНК в отсутствие UmuD’, UmuC или RecA была оценена в ~0, 5%, однако при наличии всех компонентов в реакционной смеси эффективность преодоления поврежденного участка увеличивалась в 10 раз. Очищенная ДНК-полимераза I не заменяет ДНК-полимеразу III в этих опытах. Настоящая роль белкового комплекса (UmuD’)₂–UmuC в данном процессе неизвестна. Предполагают, что комплекс может изменять процессивность ДНК-полимеразы, подавлять ее корректирующую 3’→ 5’-экзонуклеазную активность или изменять конформацию фермента на такую, при которой она начинает неадекватно оценивать пространственную структуру комплекса, образующегося с участием Уотсон–Криковских водородных связей между нуклеотидом матрицы и очередным входящим нуклеотидом. Любое из этих изменений должно сопровождаться повышением частоты ошибочного включения нуклеотидов. Недавно (1998 г.) было установлено, что тример (UmuD’)₂–UmuC сам по себе обладает слабой ДНК-полимеразной активностью и, возможно, именно этот комплекс осуществляет синтез ДНК непосредственно в поврежденном участке в присутствии всех вышеупомянутых компонентов. В этой связи тример получил название ДНК-полимеразы V Е. coli.

Белок Rev1 дрожжей, гомологичный белку UmuC E. coli, в очищенном состоянии обладает способностью неспецифически включать остатки dCMP в строящуюся цепь ДНК на участке матрицы, в котором отсутствуют азотистые основания. На этом основании он был отнесен к ДНК-полимеразам и был назван дезоксицитидилтрансферазой.

Уникальными свойствами обладает новая ДНК-полимераза IV E. coli, кодируемая геном dinB, которая также участвует в SOS-ответе бактерий. Очищенная до состояния, близкого к гомогенному (1999 г.), она не обладает 3'→ 5'-экзонуклеазной активностью и способна включать нуклеотиды в строящуюся цепь ДНК по высокодистрибутивному механизму. При каждом контакте фермента с субстратом и гибридом праймер–матрица к праймеру присоединяется единственный нуклеотид. В том случае, если вблизи 3'-конца праймера присутствует ошибочно спаренный нуклеотид (особенно пара G–G), то ДНК-полимераза IV в процессе синтеза ДНК осуществляет сдвиг рамки считывания в результате делеции одного нуклеотида. Такой механизм может потенциально исправить мутагенные последствия смещения 3'-конца праймера по отношению к правильной рамке считывания в поврежденной ДНК-матрице. Полагают, что если во время репликации участков ДНК с простыми повторяющимися последовательностями в результате их повреждения происходит включение неправильно спаренного нуклеотида с последующим проскальзыванием 3'-конца строящейся цепи ДНК и образованием мутации со сдвигом рамки считывания, то происходит задержка репликативного комплекса и его диссоциация. В этих условиях синтез ДНК может быть продолжен ДНК-полимеразой IV, которая путем внесения дополнительных мутаций может исправить первоначальный сдвиг рамки.

Таким образом, SOS-мутагенез дает возможность микроорганизмам преодолевать летальное действие повреждений ДНК, что особенно важно при нарушениях ее структуры, которые блокируют репликацию ДНК и с которыми не справляется обычная репаративная система. В этом смысле наиболее опасны одноцепочечные бреши, в которых сохранившаяся цепь не содержит азотистых оснований. При таком развитии событий SOS-мутагенез является вторичным процессом – следствием заполнения бреши случайными нуклеотидами. Однако при некоторых видах повреждений во время SOS-ответа в растущую цепь ДНК включаются нуклеотиды, восстанавливающие ее исходную первичную структуру, т.е. происходит истинная репарация повреждений. В этой связи второй функцией SOS-мутагенеза может быть предоставление микроорганизму возможности противостоять определенным генотоксическим воздействиям окружающей среды, а именно таким классам химических мутагенов, последствия действия которых не преодолеваются системами эксцизионной или иной репарации, функционирующими с высокой точностью. Система SOS-мутагенеза, по-видимому, обеспечивает протекание последовательности реакций, обозначаемых как " повторный старт репликации", что имеет место после временной (на 30–45 мин) задержки синтеза ДНК в ответ на ее повреждения генотоксическими агентами. Не исключено также, что SOS-мутагенез создает бактериальным клеткам определенные эволюционные преимущества, так как способствует поддержанию генетического разнообразия в популяциях этих микроорганизмов.