Студопедия

Главная страница Случайная страница

Разделы сайта

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Механизм синтеза эукариотической ДНК






 

Выше указывалось, что для инициации репликации ДНК, каждая точка начала репликации связывает комплекс [ORC · Cdc6p · Cdt1] и множество гексамерных комплексов Mcm. (Описание основных ферментов и белковых факторов, участвующих в репликации эукариотической ДНК приведено в табл. 4.2). Вполне понятно, что для начала репликации спаренные цепи материнской двойной спирали должны быть разделены. Это позволит ДНК-полимеразе связаться с ДНК и приступить к синтезу дочерних цепей.

 

Таблица 4.2

 

Ферменты и белковые факторы, необходимые для репликации ДНК в экстрактах эукариотических клеток

 

Активность Белок* (размер)
Узнавание точки начала репликации Вирус SV40 и исходные бесклеточные экстракты Эукариоты   Большой Т антиген вируса SV40 (82 kD)   ORC (комплекс узнавания точки начала репликации) (120, 72, 62, 56, 53, 50 kD)
Активация точки начала репликации Протеин фосфатаза 2А (34, 32 kD)
Разделение цепей ДНК (геликаза) Большой Т антиген вируса SV40 Mcm-белки
Стабилизация одиночных цепей ДНК комплекс полимераза/праймаза RP-A (субъединицы: 70 [ssДНК связывание], р32, р11) ДНК-полимераза α (cубъедицы: р180 [полимераза], р70 [стимулирует сборку праймосомы], р58 [стабилизация и активация р48], р48 [праймаза]; отсутствие самокоррекции.
Репликативные полимеразы ДНК-полимераза δ (р125 [полимераза], р48 + другие ДНК-полимераза ε (205, 70 kD обладает 3/→ 5/-экзонуклеазной корректирующей активностью.
Вспомогательные факторы PCNA (36 kD); кольцеобразная «муфта», которая скользит вдоль ДНК; удерживает ДНК-полимеразы δ и ε на матричной цепи ДНК; включается в процесс координации регуляции клеточного цикла, репликации и репарации
Вспомогательный белок для PCNA PFC (145, 40, 38, 37, 36.5 kD) связывается с участком праймер: матричная цепь; присоединение фактора PCNA; необходим для переключения (связывания) полимеразы
Заключительные факторы удаление РНК-праймеров лигирование фрагментов ДНК удаление напряжения от суперспи-рализации разделение дочерних ДНК   Fen1 5/→ 3/-экзонуклеаза (46 kD) + РНКаза H (49, 39 kD) ДНК-лигаза I (102 kD) ДНК-топоизомераза I (100 kD)   ДНК-топоизомераза II (175 kD)

 

*Идентичность (тождественность) некоторых компонентов включаемых в реакции, приведенные в таблице, были впервые составлены, используя модель репликации ДНК in vitro. Эти системы базировались на процессе репликации ДНК в экстрактах клеток инфицированных вирусом SV40. Данный вирус обладает небольшим кольцевым геномом с определенной точкой начала репликации. Основная причина, почему вирус SV40 является настолько подходящей модельной системой для изучения репликации ДНК, заключается в том, что вирус использует только один вирусный белок – большой Т антиген – для его собственной репликации. Все остальные ферменты и белковые факторы репликации предоставляются клеткой-хозяином.

Если не указано отдельно, размеры субъединиц приведены для белков человека.

 

 

Рис. 4.17А-В Инициация репликации посредством фосфорилирования белка Cdc6p под действием киназы Cdk2-циклин А и фосфорилирования Mcm-геликазы киназой Cdc7p-Dbf4p (Pollard T.D., Earnshaw W.C., Cell Biology, Saunders, 2002).

 

Репликация ДНК начинается с фосфорилирования Cdc6p и белков комплекса Mcm (см. рис. 4.17А). Роль фосфорилирования комплекса Mcm (с участием киназы Cdc7p-Dbf4p) еще до конца не установлена. Фосфорилирование же белка Cdc6p киназой Cdk2-циклин А (как указывалось выше) служит причиной того, что этот белок утрачивает способность взаимодействовать с белками Mcm, помогая тем самым начать репликацию. Фосфорилированные Cdc6p и Cdt1 покидают ДНК и движутся в цитоплазму (третий механизм регуляции «лицензирования»), где их судьба различна у разных организмов.

Например, в клетках млекопитающих изолированный в цитоплазме Cdc6p достаточно стабилен и используется повторно для связывания с точками начала репликации. У дрожжей цитоплазматический Cdc6p подвергается полному разрушению.

Исследования репликации ДНК у эукариот позволили установить, что следующий этап заключается в активации Mcm-геликазы (путем ее фосфорилирования) – фермента, который, используя энергию гидролиза АТР, разделяет спаренные цепи двойной спирали ДНК.

Высвобождение Cdc6p сопровождается связыванием c ДНК в точке начала репликации белка Cdc45p и ssb-белков эукариот – RP - A (рис. 4.17В). Полагают, что взаимодействие Cdc45p с комплексом Mcm способствует последующему связыванию белков RP-A с одноцепочечными участками ДНК. В настоящее время кажется вполне вероятным, что этот ассоциат тем или иным способом дополнительно активирует Mcm-геликазу. На следующей стадии белки Cdc45p и RP-A привлекают в точку начала репликации ДНК-полимеразу a (рис. 4.17С). По мере того, как геликаза начинает разделять цепи ДНК, двигаясь в двух противоположных направлениях от точки начала репликации, белки RP-A стабилизируют разделенные цепи так, что исчезает потенциальная возможность спаривания оснований в пределах одной и той же одиночной цепи.

 

 

Рис. 4.17С-D Формирование комплекса ДНК-полимеразы α с праймазой обеспечивает начало синтеза РНК-праймера (Pollard T.D., Earnshaw W.C., Cell Biology, Saunders, 2002).

 

Разделенные цепи двойной спирали ДНК готовы на этом этапе к процессу удвоения, но синтез цепей ДНК всегда включает присоединение приходящих нуклеозидтрифосфатов к свободной 3/-ОН-группе на конце предсуществующего полинуклеотида. Каким образом в отсутствие предсуществующей цепи ДНК со свободным 3/-ОН-концом ДНК-полимераза может осуществить начало синтеза? Эта проблема успешно разрешается благодаря участию ДНК-зависимой РНК-полимеразы, называемой праймазой, которая подобно другим РНК-полимеразам может инициировать синтез олигонуклеотида de novo, не нуждаясь при этом в наличии готового 3/-ОН-конца. У эукариот синтез цепей ДНК в любом случае начинается с участием всех субъединиц ДНК-полимеразы α и праймазы, которые в целом известны как комплекс ДНК-полимераза α /Праймаза. Праймаза синтезирует комплементарный материнской цепи фрагмент РНК размером около 10 нуклеотидов, к которому ДНК-полимераза α присоединяет 20-30 дезоксинуклеотидов, так называемой инициаторной ДНК (iДНК) (см. рис. 4.17D и Е). Эти инициаторные реакции синтеза ДНК являются потенциально опасными для этой информационной молекулы, поскольку ДНК-полимераза α не обладает какой-либо корректирующей активностью. Любые ошибочно присоединенные основания неизбежно вызовут появление мутации. Из сказанного выше следует, что все события, характерные для инициации репликации полного генома, потенциально могут приводить к появлению ошибок в структуре ДНК. Поэтому и РНК-праймер, и большая часть или даже вся iДНК, синтезированные с участием комплекса Polα /Primase, впоследствии замещаются «правильными» дезоксинуклеотидами.

 

 

 

Рис. 4.17E-F После присоединения к РНК-праймеру 20-30 дезоксинуклеотидов, так называемой инициаторной ДНК (iДНК) под действием ДНК-полимеразы α белок RFC способствует отделению комплекса ДНК-полимераза α /Праймаза и связыванию тримерного белка PCNA (Pollard T.D., Earnshaw W.C., Cell Biology, Saunders, 2002).

 

После того, как комплекс ДНК-полимераза α /Праймаза выполнил свою функцию, в репликацию включаются два других важных фактора. В частности, пентамерный белковый комплекс называемый RFC ( r eplication f actor C ) связывается с 3/-концом инициаторной ДНК. Фактор RFC, используя энергию гидролиза АТР, обеспечивает присоединение к ДНК тримерного белка PCNA (рис. 4.17F и 4.17G). Тример PCNA имеет муфтообразную форму и после того как ДНК встраивается в его центральный канал, PCNA топологически защелкивается на материнской цепи ДНК. Связывание фактора RFC и защелкивание PCNA приводит к вытеснению комплекса ДНК-полимераза α /Праймаза и затем PCNA обеспечивает связывание ДНК-полимеразы δ (возможно и ДНК-полимеразы ε) с ДНК в области присутствия 3/-концевой ОН-группы инициаторной ДНК. Двигаясь вместе с тримером PCNA, который используется как подобие скользящей «платформы», ДНК-полимераза δ приступает к синтезу непрерывной дочерней цепи ДНК (рис. 4.17Н). На отстающей цепи ДНК-полимераза ε синтезирует фрагмент из примерно 250 нуклеотидов до тех пор, пока не натолкнутся на следующий фрагмент Оказаки. В настоящее время считают, что Cdc45p является тем остó вным фактором, который удерживает вместе гексамерную Mcm-геликазу и репликативные ДНК-полимеразы по мере движения репликативной вилки.

Как ДНК-полимераза δ, так и ДНК-полимераза ε обладают корректирующей экзонуклеазной активностью. Это позволяет им контролировать правильность присоединения нуклеотидов в новосинтезированной цепи ДНК и исправлять любые ошибки, которые они могут допустить в ходе реакции полимеризации. Данная способность ДНК-полимераз δ и ε к самокоррекции объясняет ту поразительную точность, с которой проходит репликация ДНК (обычно частота ошибок не превышает 1 на 109 пар оснований в реплицированной молекуле).

 

Рис. 4.17G-I После присоединения к РНК-праймеру 20-30 дезоксинуклеотидов, так называемой инициаторной ДНК (iДНК) под действием ДНК-полимеразы α белок RFC способствует отделению комплекса ДНК-полимераза α /Праймаза и связыванию тримерного белка PCNA (Pollard T.D., Earnshaw W.C., Cell Biology, Saunders, 2002).

 

На заключительных стадиях репликации ДНК происходит удаление РНК-праймеров (а также инициаторной ДНК) и лигирование соседних фрагментов новосинтезированной ДНК. Удаление праймера может быть выполнено двумя способами (рис. 4.17I). С одной стороны, специфичная к РНК экзонуклеаза, называемая РНКазой Н (Rnase H), может выщеплять рибонуклеотиды праймера с его 5/-конца. Однако этот фермент не в состоянии удалить последний рибонуклеотид, который соединен с инициаторной ДНК. Его удаление требует присутствия другой нуклеазы, называемой Fen1. Белок Fen1 (являющийся экзонуклеазой) способен удалить весь праймер, но для этого требуется участие геликазы. В этом случае геликаза должна разделить цепочку праймера (а также инициаторной ДНК) и материнскую ДНК, создавая при этом как бы «ус». Затем Fen1 удаляет ненужные нуклеотиды, входящие в состав отделенного «уса» путем их отщепления в одну стадию по месту соединения с «правильной» ДНК. У дрожжей такая вспомогательная геликаза охарактеризована и названа белком Dna2.

После удаления инициаторной РНК (ДНК) комплекс Polδ /PCNA продолжает синтезировать дочернюю цепь ДНК до тех пор, пока не натолкнется на 5/-конец сформированный Fen1. После этого ДНК-лигаза I соединяет вместе две цепи ДНК.

 






© 2023 :: MyLektsii.ru :: Мои Лекции
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
Копирование текстов разрешено только с указанием индексируемой ссылки на источник.