Бактериологический метод

ИССЛЕДОВАНИЯ НА ПРИМЕРЕ СТАФИЛОКОККОВ

Кокки - это обширная группа микроорганизмов, включающая патогенных, условно-патогенных представителей. Общим признаком для всех патогенных кокков является их способность вызывать гнойные процессы. Все патогенные кокки неподвижны. Стафилококки имеют вид круглых шаров, размножаясь они образуют грозди винограда. Вырабатывают сахоролитические и протеолитические ферменты. Вырабатывают экзотоксин, энтеротоксин. К стафилококкам чувствительны скот, лошади, свиньи, куры. Пути передачи: контактно - бытовой, воздушно - капельный, воздушно - пылевой, пищевой. Проникают через кожу и слизистые.

Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

Материал для исследования:

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).

2. Слизь из зева (ангина)

3. Мокрота (пневмония)

4. Моча (цистит)

5. Дуоденальное содержимое (холецистит)

6. Кровь (подозрение на сепсис)

7. Рвотные мессы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые - токсикоинфекции или отравления)

8. Слизь из носа (обследование на бактеоносительство).

Основные методы исследования:

1. Микроскопический
2. Биологический
3. Микробиологический

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ:

ПЕРВЫЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:,

Способы сбора исследуемого материала:

1. Гной из поражённых участков

Материал следует брать из глубоких слоев поражённого участка. При наличии открытых процессов гной берут стерильным тампоном, пастеровской пипеткой, платиновой петлёй, при закрытых абсцессах - стерильным шприцем.

2. Отделяемое слизистых оболочек носа, зева

Материал берут стерильным тампоном.

3. Мокрота

Собирают в стерильную посуду. ^:

4. Моча

Собирают в стерильную посуду (следует брать утреннюю мочу катетером)

5. Дуоденальное содержимое

В стерильные пробирки собирают порции А, В, С (можно в одну).

6. Кровь

10-15 мл. Берут стерильным шприцом или иглой из локтевой вены.

7. Рвотные массы

Собирают в стерильную посуду

8. Промывные воды желудка.

Собирают в стерильную посуду

Все посевы ставят в термостат на сутки. Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса в осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.

Методы исследования:

1. Гной

Засевают на желточно - солевой агар и на агар с 3 - 5% кропи в чашках Петри. Параллельно из гноя делают мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопируют.

2. Отделяемое слизистых оболочек

Засевают на желточно - солевой агар и кровяной агар.

3.Моча

Центрифугируют, полученный осадок засевают на желточно - солевой и кровяной агар. Делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

4. Мокрота, дуоденальное содержимое

Засевают на желточно - солевой и кровяной агар.

5. Рвотные массы и пищевые продукты:

Предварительно растирают в ступке и эмульгируют в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида. 1 - 2 мл эмульсии засевают на желточно - солевой агар. Для получения изолированных колоний на чашки Петри исследуемый материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды.

Кровь засевают в сахарный бульон.

ВТОРОЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококков колонии, выросшие на желточно – солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой I культуры. При этом учитывают наличие лицетиназы, которое проявляется в образовании венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащем кровь. Колонии с чёткой зоной гемолиза (просветления) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови на сахарный бульоне инкубируют 10 суток, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно - солевую среду. При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

ТРЕТИЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенном агаре культур делают мазки, окрашивают по методу Грама и микроскопиют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшие изучение выделенной культуры:

1. ставят реакцию плазмокоагуляции

2. изучают гемолитические свойства

3. определяют продукцию ДНКазы

4. определяют ферментацию монната в анаэробных условиях

5. определяют устойчивость к антибиотикам

Реакция плазмокоагуляции.

Цитратную плазму, получаемую из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соответствии 1: 4 и наливают в две преципитатные пробирки по 0, 3 - 0, 5 мл; В одну вносят петлю исследуемой культуры, другая служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37 С. Учет реакции производят через 2-3 часа. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре (24 С), после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свёртывается.

(не выливается из перевёрнутой пробирки).

В контрольной пробирке плазма не изменяет консистенции.

Определение гемолитических свойств:

Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие Альфа-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличий и на бараньей крови; продуцирующие Бетта-гемолизин лизируют только эритроциты барана).

Определение ДНКазы.

Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 часов на чашку с выросшими колониями стафилококков добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу он деполимерезуется ДНК и помутнение не образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий ат«р с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18 - 24 часа при температуре 37 С. Положительная реакции характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

ЧЕТВЁРТЫЙ ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют.

Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококка, выделенного от разных больных и из объекта внешней среды. Для фаготипирования используют критические тест - разведения фагов. Это максимальное разведение фагов, при котором происходит лизис, соответствующего штамма стафилококка. В чашку Петри наливают 15% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30 - 40 минут. На 1 мл 4-6 часовой культуры выделенного стафилококка, распределённого на поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке.

Дно чашки делят на секторы или квадраты. Число секторов соответствует количеству фагов. Затем на каждый квадрат наносят 1 - ин фаг. Чашки ставят в термостат при температуре 37 С результаты определяют через 6-7 часов. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учёт производится через 18 - 24 часа. Полученную культуру стафилококков проверяют на чувствительность к антибиотикам. | Метод дисков

Взвесь полученной культуру высевают " газоном". В качестве посевного материала используют суточную бульонную культуру или 1 взвесь микробов. Засеянные чашки подсушивают 30 - 40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянногоагара накладывают пинцетом бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки, одна чашка служит для изучения 1 - ого штамма к 4 - 5 антибиотикам. Засеянные чашки с нанесёнными на них дисками помещают в термостат при температуре 37 градусов на 18 - 24 часа. Чашки ставят вверх дном, чтобы избежать попадания конденсационной волы на поверхность посева. Учёт результатов:

Действие антибиотиков оценивают по феномену задержки роста вокруг диска. Диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков определяют с помощью линейки, включая диаметр самого диска. Между степенью чувствительности и величиной зоны отсутствия роста есть зависимость. В ответе указывают чувствительность штамма. В ряде случаев определяют чувствительность микроорганизмов к антибиотикам в наживном материале (гной и др.).

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Схема выделения и идентификации стафилококка

Контрольные вопросы

1. Что входит в понятие «бактериологическое исследование»?

2. Какой должна быть культура для такого исследования?

3. Что такое колония микробов, культура, штамм, клон?

4. Что входит в понятие «культурные свойства микробов»?

5. Что означает фаготипирование?

6. Что означает идентификация микроорганизмов?

7. Каким способом определяется чувствительность микроорганизмов к антибиотикам?

8. Какие исследования проводятся на каждом из четырех этапов изучения возбудителя?