Электронная

изображение создает поток пролетевших или отразившихся е на детекторе

просвечивающая

растровая

можно видеть атомы

для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях используется электронная микроскопия. В данном типе микроскопии светомикроскопические исследования живых клеток подкрепляются обработкой изображений с помощью электроники, что существенно усиливает чувствительность и увеличивает разрешене. Разрешение эл микроскопа достигает 0, 1 нм.-1 ангстрем.

Световая микроскопия является основным методом изучения клеток и внутриклеточных структур. Методами световой микроскопии можно установить форму клеток, агрегированность клеток и их размеры. Световые волны не могут отражаться от объектов, которые меньше половины длины волны. Этот дифракционный предел ограничивает разрешение обычного светового микроскопа, использующего видимый свет, в пределах 200 нм.

Изучать более мелкие объекты можно с помощью электронного микроскопа, способного различать даже отдельные атомы. Электронный микроскоп способен оценивать поверхностные структуры, но внутрь живой клетки заглянуть не может и требует очень тонких срезов для изучения клеток.

Британские ученые из манчестерского универа и сингапура изобрели прогрессивную модель светового микроскопа «микросферный наноскоп» с прозрачной микросферой, который позволяет наблюдать в видимом свете объекты размером до 50 – 120 нм, дает четкое изображение внутренней структуры клетки и обеспечивает возможность исследовать внедряющиеся в клетку вирусы. Принцип его работы основывается на сборе микросферами- линзами, размером 2-9 микрон т.н. эванесцентных (затухающих) волн, существующих только вблзи самой гарницы рассматриваемого предмета. Эти волны ближнего поля ограничены дифракционным пределом и способны формировать изображение с необычайно высоким разрешением. Микросферы из диоксида кремния, улавливая эти волны, обычно исчезающие в считанных нанометрах от исследуемого образца, преобразуют из в световые волны, и фокусируют их так, чтобы стандартная линза оптического микроскопа могла показать изображение.

6. Оптическая светопольная микроскопия. Факторы, определяющие увеличение микроскопа. Апертура. Разрешающая способность микроскопа.

световая микроскопия основана на законах оптики и волновой теории образования изображения

факторы - разрешающая способность, характер и направленность светового луча, особенности изучаемого объекта

в зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света - цвет, якость, фаза, плотность

изменение данной длинны волны может быть использовано для изучения только таких структур, минимальные размеры которых сопоставимы с длинной волны самого излучения. (0, 4 ф - 0.7 к)

Апертура - характеристика оптического прибора, описывающая его способность собирать свет и противостоять дифракционному разложению деталей изображения

Числовая апертура объективов, граничащих с воздухом не может быть больше 1. Т.к. показатель преломления воздуха = 1. Для увеличения разрешающей способности на препарат помещают иммерсионное масло (часто кедровое) т.к. его показатель преломления 1, 51 (у стекла 1, 52) => проходя через эти среды луч не сильно отклоняется от оси.

Апертурная диафрагма - ограничивает диаметр световых пучков.

разрешение прямо пропорционально апертуре

значение апертуры

α - угол между крайними лучами светового пучка системы

n - показатель преломления среды (в иммерсионной системе будет отличным от 1, в зависимости от типа масла)

иммерсионная - жидк - масло. увеличивает аппертуру

чем выше аппертура, тем выше разрешающая способность микроскопа

длинна волны - 0.4 мкм, аппертура - 1.4 - предел разрешающей способности.

Разрешающая способность - свойство изображать мельчайшие детали препарата, характеризующиеся наименьшим расстоянием, при котором различают две точки, тесно расположенные др к др

δ - разрешающая способность, λ - длинна волны, А - аппертура

Устройство:

- механическое: штатив, тубусодержатель, тубус, револьвер, предметный столик

- оптическое - объектив, окуляр, осветитель (зеркало, лампа, конденсор)

объектив характеризуется увеличением, фокусным расстоянием, разрешающей способностью, аппертурой,

окуляр - собирающая линза

общее увеличение микроскопа - увел окуляра*увел объектива

7. Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия.

Зигмонди - 1903 (1906?)

микроскопия в темном поле - изучение малых и слабоконтрастных объективов

темнопольный конденсор - пропускает только краевые лучи, освещающие препарат, но не попадающие в объектив

темнопольный конденсор - пропускает только краевые лучи, освещающие препарат, но не попадающие в объектив. Клетки и их компоненты обладают различной оптической плотностью и по разному рассеивают попадающие на них лучи. Изображение создается только светом, рассеянным элементами структуры препарата, еоторые отличаются от окружающей среды показателем преломления. В поле зрения микроскопа на темном фоне видны светлые изображения деталей. Темнопольная микроскопия позволяет получить представление о внешней форме живых неокрашенных объектов и их движении. Повышение разрешающая спообность за счет увеличения аппертурного угла

Фазово-контрастная - для наблюдения прозрачных непоглощающих объектов, отличающихся от среды показателем преломления. Вследствие этого различия световая волна проходит сквозь объект с разной скоростью, претерпевает изменения по фазе и приобретает фазовый рельеф. Фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно глазом или фотопластинкой, с помощью специальной фазовой пластинки (фазового кольца) переводят в амплитудные изменения(амплитудный рельеф), видимый глазом.

световая волна приобретает фазовый рельеф

Цернике - 1935

доп устройства к микроскопу - вспомогательный окуляр, фазовые объективы, конденсор с набором кольцевых диафрагм

качество улучшается за счет увеличения контрастности

разновидность - амплитудно-контрастная

8. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Особенности оптической системы флуоресцентного микроскопа. Красители, использующиеся в флуоресцентной микроскопии

основана на способности некоторых объектов светиться при освещении уф

(люминесценция киш палочки в уф-диапазоне)

применяется как для фиксированных, так и для живых препаратов

живые:

- для изучения функционального состояния и физ-хим характеристик

-выявления специфических белков - связывающихся с определенным красителем

-анализ изменений концентраций и расположения специфических макромолекул в живых клетках

Красители флюорохромы:

флуоресцеин - желто-зеленый, после возбуждения голубым диапазоном

родамин - темно красный, после возбуждения желто-зеленым диапазоном

Отличие от обычного микроскопа - источник света и наличие светофильтра в осветительной системе и после объектива

первый - на осетителе, второй в окуляре - пропускает только люминесценцию препарата

при поглощении уф энергии молекулы в-ва переходят в возбужденное состояние - сл, электроны находятся на более высоких уровнях

возвращение в нормальное состояние путем излучения энергии – флуоресценция

Как правило, спектр флуоресценции смещен по сравнению со спектром поглощения возбуждающего света в сторону более длинных волн (правило Стокса) – связано с перераспределением энергетических уровнеймолекул и уменьшением энергии кванта, излучаемого веществом, по сравнению с квантом поглощаемого света.

цвет свечения зависит от химической структуры и физ-хим состояния объекта

уф-микроскопия - для неокрашеннх объектов

9. Электронная микроскопия – принцип метода. Сканирующая и просвечивающая (трансмиссинная) микроскопия. Особенности и возможности методов.

вместо видимого света используется пучок электронов

в роли линзы - электрические и магнитные поля

в электронном микроскопе изображение строится за счет разности рассеивания электронов от соседних участков

Ценность - разрешение намного больше чем у оптики, тк у электрона малая длинна волны

э.микроскоп позволяет исследовать только неживые препараты

контраст вызван отклонением ускоренных электронов тяжелыми атомами, входящими в состав препарата. те дифракционный контраст

1 линза - вакуумная колонка для электронного пучка - обеспечение эмиссии и ускорение электронов

часть электронов образует электронный луч, падающий на тонкопленочный объект

прошедшие через объект электроны фокусируются второй линзой, которой увеличивается объект, затем третья линза еще раз увеличивает, а потом изображение проецируется на экран или фотопленку.

Основная часть микроскопа- вакуумная колонна, в которой последовательно расположены по принципу осевой симметрии электронная пушка, содержащая катод и анод, ряд магнитных линз и люминесцирующий экран. Электронная пушка обеспечивает эмиссию и ускорение электронов. Часть электронов проходит через отверстие в центре анода (центральную апертуру) и образует электронный луч, который фокусируется первой магнитной линзой (конденсорной) и освещает объект. Прошедшие через электроны фокусируются второй магнитной линзой (объективной), формирующей увеличенное изображение объекта, которое затем дополнительно увеличивается третьей магнитной линзой(проекционной) и проецируется на люминесцирующий экран или фотопленку. Качество изображения определяется контрастом. Его повышают с помощью солей тяжелых металлов (свинец, вольфрам, уран) – они или на самом объекте- позитивное контрастирование, или фоном- негативное контрастирование. Биологические объекты исследуются на спец сетках, покрытых пленками из коллодия и формвара (хз что это).

применение метода:

изучение тонкой структуры клеток, локализаций специфических макромолекул

Трансмиссионный ЭМ (просвечивающий, ПЭМ\ТЭМ)

просвечивает тонкий препарат пучком электронов (вышеописаный механизм с тремя линзами) - изучение микроструктур клетки

Сканирующий ЭМ (растровый, РЭМ\СЭМ)

сканирует поверхность образца пучком электронов, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа, по аналогии с формированием телевизионного изображения. Различия в интенсивности вторичных излучений преобразуются в изменение амплитуды электрических сигналов, что регистрируется на экране или фотопленке. Достигаемое при этом увеличение меньше, чем в ТЭМ, не превышает 50000 крат (3-5 нм).

Преимущества сканирующей в сравнения с трансмиссионной: с ее помощью можно получать трехмерное изображение биологических объектов, изучать рельеф поверхности их отдельных клеток или составляющих клетки структур, различать детали строения поверхностей. Большая глубина резкости. Ее можно усилить, наклонив образец до 45 градусов.и с помощью динамического фокусирования.

Специальная подготовка объекта:

Фиксация, обезвоживание, высушивание клеток методами, щадящими их поверхность. Препарат облучают мощным потоком электронов, таким образом получают отпечаток (реплику) поверхности, которую потом сканируют. В качестве регистрируемого вторичного излучения выбирают, прежде всего, вторичные электроны. Т.к. их легко регистрировать и они покидают объект только из тонкого поверхностного слоя (10нм).

Химическую фиксацию образца проводят глутаровым альдегидом.

Метод высушивания: - высушивание в критической точке, при повышении темп. Выше крит. Точки, жидкость переходит в пар по всему объему объекта.при повышенном давлении. В это время образец находится в безводном ацетоне. Либо после быстрого глубокого замораживания в жидком азоте с присутствием криопротекторов..

Затем образцы прикрепляют к немагнитным столикам с помощью 2стороннего скотча (ну надо же) (образцы вместе с покровными стеклами). затем наносят сверхтонкую (до 20нм) пленку сплавов золото/палладий или платина/палладий. Для этого используют метод вакуумного ускорения или ионнго распыления.

С помощью СЭМ можно получить стереомикрофотографии, что позволяет рассчитывать истинные расстояния между точками изображенной поверхности и восстанавливать взаимное расположение структур в пространстве.

В настоящее время широко используется СЗМ – сканирующий зондовый микроскоп, который для сканирования использует иглу. в результате получают трехмерное изображение поверхности с высоким разрешением.

разрешение до 0.4 нм

10. Техника подготовки препаратов для микроскопии. Фиксация и окраска клеток.

постоянный препарат нужно обработать фиксирующим агентом, для сохранения клетки.

Фиксация, образовывает структуры в клеточной оболочке, препятствующие разрушению клетки, консервирующие ее, а так же повышает степень сродства красителя и клетки

Альдегиды формируют связи между молекулами клеточн мембран и мембран органелл – сеть. Сшивают молекулы ковалентными связями, вытесняя водород

Не стабилизируют ненасыщеные липиды и фосфолипиды

Сриты – осаждают белки, обезвоживают и уплотняют клетки. Белки потом доступны для действия ферментов.

после фиксации ткани режут на макротоме. срез помещается на стекло и замораживается или пропитывается парафином или смолами. потом режется на микротоме

следующий этап- окраска

малахитовый зеленый, судан черный, кумасси синий, и тд..

каждый краситель красит определенные молекулы:

напр гематоксилин - нк и кислые белки

судан черный - жиры