Хроматография

11. Хроматография. Наиболее существенные открытия в развитии методов хроматографии. Теория хроматографического процесса. Классификация хроматографических методов.

физико-химический метод разделения и анализа смесей газов, жидкостей и растворенных веществ, основанный на многократном повторении актов сорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента

метод основан на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами (подвижной - ж. или г. и неподвижной - тв.).скорость продвижения вещества зависит от степени сродства к той или иной фазе. чем выше сродство к неподвижной фазе - тем дольше задерживается на сорбенте. если у компонентов смеси эти степени сродства разные, то они разделяются.

! скорость миграции вещества должна быть меньше скорости миграции подвижной фазы (напр. растворителя)

преимущества метода:

1 - с помощью него можно проводить разделение, идентифицировать вво по скорости распределения, определять количество вещества в исходном растворе за один раз - т.е. высокая информативность метода

2 - можно использовать для повышения концентрации веществ

3 - универсальный метод для любых веществ

4 - высокая избирательность и низкий предел обнаружения, высокая чувствительность.

абсорбент - растворяет в себе газы, жидкости смеси

адсорбент - концентрирует на своей поверхности газы

неподвижная фаза - твердый сорбент или жидкость, несмешивающаяся с жидкой фазой, на кот. происходит дифференциальное удерживание компонентов и их разделение

подвижная фаза - поток ж или г, переносящий компоненты смеси вдоль неподвижной фазы.

сорбат - то, что удерживается сорбентом

сорбент - в-во, поглощающее или удерживающее неподвижную фазу в хроматорафии.

элюат - выходящий поток, смесь подвижной фазы и компонентов смеси

элюент - в-во, используемое в качестве подвижной фазы.

классификация:

1) по агрегатному состоянию - жидкостная, газовая

2) по механизму взаимодействия в-ва и сорбента

- адсорбционная (на поверхности) ионообменная, тонкослойная, жидкостная, газоадсорбционная.

- распределительная (на растворимость вва в неподвидной фазе), газожидкостная, или на различной растворимости вв в подвижной и неподвижной фазах (жидкостная)

- ионообменная – основана на разной способности вв к ионному обмену

- эксклюзионная – гель-фильтрация. Основана на различных размерах и формах молекул разделяемых вв.

- аффинная – основана на специфических взаимодействиях характерных для некоторых биологических и биохимических процессов (антитело-антиген, гормон-рецептор, фермент-субстрат)

- осадочная – основана на образовании отличающихся по растворимости осадков разделяемых вв с сорбентом.

- адсорбционно-комплексообразовательная- основана на образовании координационных соединений разной устойчивости в фазе или на поверхности сорбента

3) по технике выполнения: колоночная, планарная

Колонки бывают:

· Насадочные – заполненные зернистым твердым материалом, либо являющимся разделительной средой, либо служащим носителем неподвижной жидкой фазы.

· Капиллярные – внутренние стенки покрыты пленкой неподвижной жидкости или слоем твердого адсорбента (поглотителя)

Планарная бывает тонкослойная и бумажная.

4) по цели проведения: аналитическая (качественный и количественный анализ смесей), препаративная (получение вв в чистом виде, концентрирование и выделение микропримесей), промышленная (автоматическое управление производственными процессами)

5) по режиму ввода пробы:

фронтальная - через колонку непрерывно пропускают смесь, компоненты разделяются не полностью и в чистом виде можно выделить только первый. Хроматограмма имеет форму ступенчатой кривой. Эффективен для выделения чистого вва из технического образца, при условии, что вво удерживается в колонке слабее всех других. Используется для очистки и смягчения воды, очистки воздуха углем, для концентрирования ценных вв из сточных вод, для очистки лекарственных препаратов.

Элюентная – позволяет полностью разделить вва. Колонку промывают подвижной фазой с меньшей сорбируемостью, чем любое из разделяемых вв.затем вводят пробу и продолжают пропускать элюэнт. На выходе получаются чистые вва, поочереди.

вытеснительная – после введения вва колонку промывают подвижной фазой с вытеснителем, обладающим большей сорбируемостью, чем любое из разделяемых вв. по мере продвижения в колонке элюэнт вытесняет вво С, которое вытесняет В и т.д. каждое вво выделяется в чистом виде, но не количественно, т.к. зоны размыты. Применяется для препаративных целей

6) по режиму подачи элюента: изократический (элюент всегда один), градиентный (создается градиент состава).

12. Жидкостная колоночная хроматография: теоретические основы, аппаратура, детекторы.

колонка - стеклянная или металлическая (нержавейка) трубка диаметром от мкм до см и длинной от см до дм, заполненная неподвижной фазой.

н.ф. - силикагель, целлюлоза, оксид алюминия

элюент поступает под давлением, что позволяет уменьшить объем гранул. (5-10 мкм)

дорого.

колонка состоит из множества слоев, которые называются теоретическими тарелками - условное деление. единица абсорбента, на которой происходит единичный акт сорбции-десорбции

является мерой разрешающей способности (эффективности) колонки

Когда две колонки с одинаковыми фазами используются в оптимальных условиях, колонка с более высоким числом тарелок на метр обеспечивает лучшее разделение.

перед началом работы через колонку необходимо пропустить определенный объем элюента

Современный жидкостной хроматограф включаеет:

- емкости для элюентов

- насосы высокого давления

- дозатор

- хроматографическую колонку

- детектор

- регистрирующий прибор

- систему управления и мат. обработки результатов.

Элюенты подаются в насос через фильтр, задерживающий пылевые частицы (больше 0, 2 мкм); иногда через элюенты пропускают небольшой ток гелия для удаления растворенного воздуха и предотвращения образования пузырьков в детекторе (особенно в случае водных и полярных элюентов). В микроколоночной хроматографии объемные скорости потока элюента ниже: 10-1000 мкл/мин.

Регистрацию хроматограмм и обработку данных проводят с помощью самописца или мини-ЭВМ, которая также рассчитывает количественные характеристики и, в некоторых случаях, качественный состав смесей. Микропроцессор обеспечивает автоматический ввод пробы, изменение по заданной программе состава элюента при градиентном элюировании, поддержание температуры колонки.

хроматограмма - последовательность сигналов детектора, вырабатывающихся при выходе из колонки отдельных потоков (пики на хроматограмме)

аналитические детекторы - идентифицируют вещества по времени удерживания абсорбентом и объему связывания

Т(r) = Tr(a)/Tr(известн)

отношение времени удерживания образца к времени удерживания известного вещества

количественный анализ - зависимость высоты или площади пика от кол-ва в-ва:

- метод абсолютной градуировки

- метод внутренней нормализации

- метод внутреннего стандарта

типы детекторов:

1. фотометрические - регистрируют светопоглощение веществом

2. рефрактометрические - определяют показатель преломления

3. электрохимические - изменение потенциала и проводимости раствора.

13. Качественный и количественный анализ в жидкостной колоночной хроматографии. Основные методы анализа. Хроматограмма, ее основные характеристики.

Качественный анализ - идентификация вещества.

Время удерживания - Тr1, Tr2,...

Относительное время удерживания - см пред вопрос

Колличественный анализ - определение концентрации, вернее, зависимости высоты или площади пика на хроматограмме от концентрации вещества

Чаще используют площадь

1) метод абсолютной градуировки

эмпирическая зависимость между площадью пика и концентрации вещества. - все нужно промерить и сделать шкалу самостоятельно

в хроматограф вводят известное кол-во градуированной смеси и определяют параметры пиков.

экспериментально определяют зависимость высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочные графики или рассчитывают соответствующие коэффициенты. Далее определяют те же характеристики пиков в анализируемой смеси, и по градуировочному графику находят концентрацию анализируемого вещества. Этот простой и точный метод является основным при определении микропримесей.

2) метод внутренней нормализации

принимают сумму каких-либо параметров пиков, например сумму высот всех пиков или сумму их площадей, за 100%. Тогда отношение высоты отдельного пика к сумме высот или отношение площади одного пика к сумме площадей при умножении на 100 будет характеризовать массовую долю (%) компонента в смеси. При таком подходе необходимо, чтобы зависимость величины измеряемого параметра от концентрации была одинаковой для всех компонентов смеси.

Ki - поправочный коэф

Si - площади пиков компонентов смеси

W(A) - массовая дола

3) метод внутреннего стандарта

в смеси есть исследуемое в-во, и стандартизированная смесь определенной концентрации, массы и тд. К исследуемой смеси добавляют стандартизированный компонент. Измеряют отношение параметров пика у компонента и у исследуемого образца. Измеряют несколько смесей разной концентрации анализируемого в-ва. Стандартизированный компонент - " коробок спичек" для масштаба.

В качестве стандартного выбирают вещество, близкое по физико-химическим свойствам к компонентам смеси.

основан на введении в анализируемую смесь определенного количества стандартного вещества. Калибровочный график представляет собой зависимость между процентным содержанием компонента и отношением высот (или площадей) пиков этого компонента и стандартного вещества. Калибровка производится путем добавления постоянного количества стандартного вещества к определенному объему различных искусственных смесей, содержащих переменные, но известные количества анализируемых компонентов. Составленные таким образом смеси анализируются на хроматографе.

G* 100

Kотн - коэф поправки

SА - площадь пика анализируемого компонента

Sстанд - площадь пика стандартизированного компонента

G - отношение массы внутреннего стандарта к массе пробы