Выделение и очистка сосудисто-эндотелиального фактора роста.

Полученный продуцент E.coli C3030/pCBD-VEGF₁₆₅ культивировали при 37⁰С до оптической плотности 0, 6-0, 7, затем индуцировали ИПТГ и выращивали при 30⁰С в течении 16 часов.

Биомассу штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF165 подвергли ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Использую сродство VEGF165 к гепарину полученный супернатант нанесли на колонку заполненную сорбентом HP Heparin-Sepharose. Элюировали градиентом раствора NaCl от 0%-100%.

Полученные фракции анализировали методом SDS-ПААГ электрофорезом на наличие димера гибридного белка.

Рис. 7. Электрофореграмма SDS-PAGE 15% в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы.

По результатом проведенного электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.

Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка по сайту TEV. Полученный концентрат обработали согласно протоколу раствором TEV протеазы и инкубировали в течении 15 часов. В результате гидролиз составил более 50%.

Рис. 8. Электрофореграмма SDS-PAGE 15% результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка.

Далее смесь содержащую продукты ферментативного гидролиза очищали от компонентов содержащих хитин связывающий домен инкубацией с хитиновым сорбентом. В результате были удалены гибридный белок и собственно хитин связывающий домен Рис.9.

Рис.9. Электрофореграмма SDS-PAGE 15%

Полученный фильтрат содержащий VEGF165 дочищали от оставшихся примесей методом ВЭЖХ а сорбенте С18. Анализ фракций осуществляли с помощью MALDI-масс-спектрометрии. Найденное значение массы VEGF₁₆₅ М_эксп = 19 165 Да соответствует расчетной величине М_расч = 19 165 Да.

Фракции содержащие чистый rhVEGF 165 были лиофилизированны. В результате выход целевого белка на конечной стадии составил 2 мг с литра биомассы.