Получение штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF165.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, с целью отбора рекомбинантов. В результате было проверенно 16 клонов на наличие экспрессии гибридного белка. На основании электрофореграммы было решено продолжить работу с клоном №12.

Рис.4. Электрофореграмма рекомбинантов.

Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).

Из биомассы клона №12 была выделена плазмида pCBD-VEGF 165 для дальнейшей работы. Выделенной плазмидой трансформировали клетки E. coli C3030. Полученный штамм продуцент проверили на наличие и характер экспрессии гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с целью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма показала наличие пятна молекулярный вес, которого соответствовал димеру химерного белка в невосстанавливающих условиях, а образцы, содержащие меркаптоэтанол, демонстрировали наличие мономера. Так же была исследована локализация в клетки экпрессированного белка. Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы в основном присутствовал в супернатанте таким образом нам удалось избежать образование телец включения характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli. На основании полученных данных было решено продолжить дальнейшую работу с данным бактериальным штаммом.

Рис. 5. Электрофореграмма SDS-PAGE 15% в восстанавливающих и невостанавливающих условиях.