Введение в ИФА

Следующий раздел кратко описывает технические и теоретические моменты, непосредственно связанные с данной лабораторной работой. Понимание учениками этих моментов чрезвычайно важно для успеха работы.

Плашки для ИФА: плашки сделаны из полистирола, который связывает (адсорбирует) белки из-за гидрофобных взаимодействий. В этом наборе используются 96-луночные плашки, разделенные на 8 снимаемых рядов (стрипов) по 12 лунок. Ученики используют один стрип на двоих. Вместимость каждой лунки около 250 мкл (μ l).

Антиген: в этом наборе в качестве антигена используется куриный гамма-глобулин (выделенный из яичных желтков), который в этой работе играет роль любого гипотетического антигена.

Время инкубации: скорость связывания определяется температурой инкубации и концентрациями реагентов. Этот набор оптимизирован так, что каждую инкубацию можно провести за 5 минут при комнатной температуре. Увеличение продолжительности инкубации или температуры приведет к усилению окраски и в частности может привести к возникновению фоновой окраски в контрольных лунках.

Забивка: вещества для забивки добавляются после связывания антигена, чтобы воспрепятствовать неспецифическому связыванию антител с пластиком, что приведет к возникновению ложноположительных результатов. Для забивки может использоваться белок или детергент (или оба вместе). Обычно для этих целей применяют Твин 20 (неионный детергент, используемый в этом наборе), обезжиренное сухое молоко, желатин и бычий сывороточный альбумин (БСА). Хотя в этом протоколе вполне достаточно использовать только Твин 20, вы можете в учебных целях добавить дополнительную стадию забивки: пусть ваши ученики после добавления антигена добавят 50 мкл 1%-го раствора желатина в промывочном буфере и инкубируют 15 минут, потом промоют лунки.

Первичные антитела: первичными антителами называются антитела, которые узнают и связывают антиген. В этом наборе в качестве первичных используются поликлональные кроличьи антитела против гамма-глобулина. В протоколе III эти антитела выступают в качестве «человеческих антител в образце сыворотки крови».

Вторичные антитела: вторичные антитела узнают и связывают первичные антитела. Они выделяются из животных другого вида, чем те, из которых были получены первичные антитела. При создании этого набора, козы были иммунизированы кроличьим иммуноглобулином IgG для того, чтобы получить из их крови вторичные антитела.

Колориметрическое определение: вторичные антитела для ИФА конъюгированы с ферментом, так, что обнаружение вторичных антител, связавшихся с первичными, происходит за счет ферментативной реакции. В этом наборе вторичные антитела конъюгированы с пероксидазой хрена. В присутствии перекиси водорода (H₂O₂) пероксидаза катализирует окисление хромогенного субстрата 3, 3’, 5, 5’-тетраметилбензидина (ТМБ) с образованием синего продукта реакции. Внимание: ТМБ светочувствителен и результаты теста должны определяться через 5-10 минут после добавления субстрата. Если инкубировать стрипы дольше, может развиться неспецифическая окраска – ее не надо учитывать в результатах теста. Через 20-30 минут цвет может поблекнуть из-за того, что ТМБ будет выпадать в осадок.

Колориметрическое определение: окисление ТМБ пероксидазой

Контроли: контроли всегда делаются одновременно с опытными образцами, чтобы удостовериться, что процедура работает нормально. Контроли могут помочь разобраться с неоднозначными результаты, возникающими из-за человеческой ошибки или загрязненных реагентов. Контроли должны быть включены в любые тесты ИФА, чтобы их результаты могли считаться действительными. Для проведения отрицательного контроля, нужно убрать из образца антиген или первичное антитело (как в данной работе), или заменить антиген на другое вещество, которое не связывается специфично с антителами. Положительный контроль всегда содержит предполагаемый антиген и первичные антитела. Отрицательный образец, в котором тест дает положительный результат, называется ложноположительным. Положительный образец, в котором тест дал отрицательные результаты, называется ложноотрицательным. Многие тесты, применяемые в диагностике, дают определенный процент ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поэтому важно подтверждение диагноза в другом независимом тесте. Например, тесты на наличие антител к ВИЧ могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные могут возникать от проведенных вакцинаций, а ложноотрицательные – от подавления иммунной системы (например, при приеме лекарств, применяемых при трансплантации) или когда тест сделан слишком рано и инфекция еще не успела развиться (Антитела против ВИЧ появляются в крови через несколько недель после заражения; появление специфических антител называется сероконверсией). Поэтому положительный тест на ВИЧ всегда дополнительно подтверждается вестерн-блотом (см. стр. 105)

В ИФА, аналогичных протоколам I и II (когда экспериментальным параметром является наличие антигена), отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие антигена. Любая окраска, которая разовьется в этих лунках, будет являться следствием: а) неспецифического связывания антител; б) экпериментальной ошибки. Подходящим положительным контролем будет являться образец, заведомо содержащий антиген. В тестах ИФА аналогичных протоколу III (в которых экспериментальным параметрам является наличие первичных антител) отрицательным контролем будут являться лунки, не содержащие первичных антител. Любая окраска, развивающаяся в этих лунках, будет следствием неспецифического связывания вторичных антител, или экспериментальной ошибки. Положительным контролем будет являться образец с добавленными первичными антителами. Специальные контрольные растворы входят в состав многих коммерчески доступных наборов для ИФА, применяемых в клинике.

Анализ результатов: ИФА может дать как качественный (да или нет) так и количественный (сколько) результат. Качественный ответ можно получить на глаз, без помощи специального оборудования. Количественные результаты тоже можно оценить на глаз и отмечать, например (++) – сильный сигнал, (+) – слабый сигнал, (+/-) – сомнительный сигнал, (-) – отсутствие сигнала. Для точного определения концентраций необходим ридер (спектрофотометр) для плашек. Этот прибор измеряет поглощение света с определенной длиной волны в каждой лунке плашки относительно поглощения в контрольных лунках. Пик поглощения синей формы TMБ – 655 нм. Контроли для количественного анализа ИФА включают набор растворов известной концентрации для построения стандартной кривой. Стандартная кривая позволяет количественно определить концентрации антигена в образце, что в свою очередь, помогает исследователю или врачу определить степень развития какого-то инфекционного заболевания. Описание того, как выполнить количественный тест ИФА (без использования спектрофотометра) приведено в приложении Г.

ИФА так часто выполняется в медицинских и научных лабораториях, что существует множество коммерчески доступных наборов для определения разных антигенов. Такие наборы включают все компоненты и контроли, необходимые для проведения теста. Доступны тесты для диагностики аутоиммунных заболеваний, вирусов, бактерий, токсинов, генетических нарушений и.т.п.

Данный учебный набор демонстрирует один из возможных конкретных методов выполнения ИФА. Он относится к группе методов с захватом антитела - когда антиген иммобилизуется на дне лунки, и антитело связывается (оказывается захваченным) антигеном. Вторичные антитела связаны с ферментом пероксидазой хрена, который способен окислять хромогенный субстрат (ТМБ), что приводит к появлению синей окраски.

В тестах, основанных на захвате антигена, на дне лунки иммобилизуются первичные антитела, к которым затем добавляется антиген. В свою очередь, антиген узнается вторичными антителами, так же конъюгированными с пероксидазой, что приводит к развитию синей окраски при добавлении ТМБ.