Механизм сопряжения дыхания и фосфорилирования в митохондриях 9 страница

Для транскрипции необходимы определенные условия:

I} участок ДНК. подлежащий трdнскрппш: должен быть pjcri.itTv:! для образования одноцелочечной матрицы (только одна цепь ДНК служит матрицей при синтезе РНК; если бы обе цепи ДНК одновременно использо­вались в качестве митрииы, то на одном транскр> штоне синтезировались бы две комплементарные РНК, несущие информацию для двух разных белков);

2) наличие рнбонуклеозидтрифосфатип (АТФ, ГТФ. УТФ ЦТФ) дли син­теза РНК;

3) наличие специальных ферментов транскрин пин ДНК-завнсимыч РНК-полимераз, синтезирующих РНК по матрице ДИК.

Механизм.транскрипции ДНК. Транскрипция имеет три фазы: инициа­цию, элонгацию и терминацию, т. е. начало, продолжение и окончание син­теза РНК (рис. 67).

Инициацкя транскрипции происходит вследствие присоедине­ния ДНК-зависимой РНК-полимеразы к промотору, обладающему высоким сродством к этому ферменту. Промотор — стартовая точка транскрипции. РНК-полимераза прокариотов состоит нз пяти разных субъединиц. Четыре из них образуют агрегат, называемый кор-ферментом (от лат. сог — сердце, сердцевина), катализирующий образование фосфодиэфирных связей между нуклеотидами в РНК. Пятая субъединица, называемая о-фактором или о-субъединицей, легко отделяется от кор-фермента. Эта о-субъединица как бы выбирает стартовую точку транскрипции, связываясь с промотором. Затем.к о-фактору, выбравшему место транскрипции, присоединяется кор- фермент. и начинает транскрипцию. Неясно, что вызывает разъединение двойной спирали ДНК в месте транскрипции. Возможно, эту функцию тоже выполняет РНК-полимераза, а может быть, есть специальный белок (типа расплетающего, как при репликации),

У эукариотов имеется три РНК-полимеразы: I, II и III. Это белки, состоя­щие из нескольких субъединиц и отличающиеся друг от друга по специфич­ности транскрипции. РНК-Полимераза I ответственна за транскрипцию генов рРНК, РНК-полимераза II —за тРНК и 5S рРНК, а РНК-полимера­за III участвует в синтезе предшественника мРНК. Очевидно, структура трех разных типов РНК-полимераз эукариотов предусматривает специфи­ческий выбор транскриптонов, содержащих информацию о структуре рРНК, тРНК и полипептидной цепи.

РНК-Полимеразы наращивают цепь всегда только в направлении 5'-»-3'. поэтому 5'-конец содержит всегда трифосфат (Ф~Ф~Ф—), а 3'—свободный ОН. Начинается синтез всех цепей РНК либо о фффА, либо с фффГ, которые

специфически спариваются со стартовыми основаниями разных транскрип- тонов.

Элонгация транскрипции происходит при скольжении РНК- полимеразы вдоль матрицы ДНК, Каждый следующий нуклеотид спари­вается с комплементарным основанием в ДНК-матрице, а РНК-полнмераза «скрепляет» его с растущей цепью РНК фосфодиэфирными связями. Скорость элонгации составляет примерно 40—50 нуклеотидов в секунду,

Терминация транскрипции происходит после достижения РНК-полимеразой нуклеотидных последовательностей ДНК, являющихся стоп-сигналами. Считают, что такими стоп-сигналами в транскриптоне могут быть поли(А) последовательности, поскольку в транскриптах на З'-конце обнаруживаются комплементарные им поли (У) последовательности. Выделен и специальный фактор терминации — р-фактор, который является белком. Он обрывает транскрипцию, каким-то образом взаимодействуя с термини­рующими последовательностями транскриптона. Благодаря терминаторам цепи РНК образуются только определенной длины.

По мере того как транскрипция подходит к концу, синтезированная РНК отделяется от ДНК. Первичные продукты транскрипции, т. е. РНК, являются полными копиями {в комплементарном изображении) транскрипто- нов ДНК- А значит, в новосинтезированной РНК имеются информативные и неинформативные участки, Причем ней и формативные участки, несущие определенные функции в транскриптоне ДНК» очевидно, не нужны в РНК и являются своеобразными издержками транскрипции. Да и перенесены они в РНК потому, что процесс транскрипции непрерывен, а «выборочное» ко­пирование только информативных (структурных) участков транскриптонов вряд ли возможно. Первичные транскрипты нужно освободить от неинфор­мативного груза и оставить только информативную часть молекул РНК, Поэтому первичный транскрнпт называют РНК-предшественником. При транскрипции образуется в основном три типа предшественников РНК:

1) предшественник мРНК, или гетерогенная ядерная РНК {сокращенно Пре-мРНК или ГяРНК), содержащая мРНК, использующуюся в цитоплазме как матрица при синтезе белка;

2) предшественники рРНК (пре-рРНК), содержащие 18S рРНК и 28S рРНК у эукэриотов и, соответственно, 16S и 23S рРНК у прокариотов;

3) предшественник тРНК (пре-тРНК).

Все пре-РНК представляют собой линейные цепи, не замыкающиеся в кольцо. Они длиннее, чем функционирующие молекулы РНК. Особенно неоднородна по молекулярной массе пре-мРНК: от 6—7S до гигантских размеров SO—70S. Это связано с разнообразием молекулярной массы белков, Информация о которых содержится именно в пре-мРНК,

В ядре эукариотов все предшественники связываются с белками, об­разуя рибонуклеопротеиды-

4. Посттраискрипциоиные изменения РНК

В ядре все предшественники РНК проходят стадию послетранскрипционного созревания, или процессинеа (см. рнс. 67). В ходе процессинга удаляются неинформативные «излишки» в пре-РНК и образуются «зрелые», функцио­нальные молекулы РНК.

Процессинг включает три операции:

1) вырезание неинформативных участков из пре-РНК;

2) сращивание информативных участков «разорванных» генов — сплай­синг;

3) модификация 5'- и З'-концевых участков РНК.

Процессинг пре-мРНК. Вырезание неинформативных участков пре-мРНК осуществляется с помощью рибонуклеаз {экзо- и эндонуклеаз). Они гидро- лизуют фосфодиэфирные связи, начиная с 5'-конца, и оставляют от пре-мРНК необходимую часть готовой мРНК. Если пре-мРНК получена с транскрил- тона, содержащего разорванные гены, то происходит вырезание интронов {участков, не несущих информации), находящихся во внутренней части пре-мРШС Оставшиеся зкзоны сращиваются а единую цепь с помощью специальных РНК-лигаз. В результате восстанавливается, уже после транс­крипции, непрерывность генов, кодирующих полипептидные цепи. Далее здесь же в ядре происходит модификация 5'- и 3'-концов образовавшейся мРНК К 5'-концу мРНК присоединяется олигонуклеотид, который называется «кол­пачком» или «нэпом». Этот «колпачок» состоит, как правило, из днух или трех метилированных нуклеотидов; концевым нуклеотидом является 7-метил- гуанозии, который соединен с остальной мРНК не 5'-*-3', а 5'-»-5' фосфо-. диэфирной связью. Этот метилированный «колпачок» защищает мРНК от. разрушения 5'-экзонуклеазами.

К З'-концу мРНК у эукариот присоединяется полиадениловый фрагмент— • поли {А), состоящий примерно из 200 нуклеотидов. Присоединение осуществ­ляется с помощью поли(А)-полимеразы. Этот поли {А)-фрагмент, очевидно, необходим для транспорта мРНК из ядра в цитоплазму.

Процессинг пре-рРНК- Пре-рРНК образуется в ядрышке, где находятся транскриптоны рРНК В ДНК ядрышка гены 18S и 28S рРНК входят в один транскриптон, где расположены тандемами, т. е. попарно друг за другом. В пре-рРНК их расположение такое же. Размеры пре-рРНК дости­гают 45S {молекулярная масса порядка 4—5 • 10^е). В ходе процессинга остается чуть больше половины пре-рРНК и освобождаются зрелые 18S и 28S рРНК. Часть нуклеотидов рРНК подвергается модификации, которая состоит в метилировании оснований. Реакция осуществляется метилтранс- феразами. В роли донора метильных групп выступает S-аденозилметионин. Зрелые рРНК соединяются в ядре с белками рибосом, поступающих сюда из цитоплазмы, н образуют малую и большую субчастицы рибосом.

Процессинг пре-тРНК. Пре-тРНК образуется в разных местах ДНК хро­мосом и содержит излишки примерно в 40 нуклеотидов по сравнению со зрелой тРНК. При процессинге рибонуклеаз а ми удаляются излишки нуклео­тидов, а затем происходит метилирование оснований тРНК- Этот процесс аналогичен метилированию рРНК. Метилирование препятствует разрушению тРНК нуклеазами. Окончательно зрелая тРНК образуется путем присоедине­ния специфической тройки нуклеотидов (акцепторного конца) — ЦЦА, кото­рое осуществляется специальной РНК-полимеразой.

Транспорт зрелых РНК из ядра в цитоплазму. В отличие от прокариот у чукапиотов имеется ядерная мембрана, черм которую необходимо доста­вить готовые РНК в цитоплазму, где происходит синтез белка. Все зрелые РНК транспортируются из ядра в цитоплазму в комплексе с белком, который дополнительно защищает их от разрушения и способствует переносу. мРНК связывается с особым белком — информофером, что означает «несущий ин­формацию». Вместе с этим белком РНК доставляется к рибосомам цитоплаз­мы, где и происходит сборка белка из аминокислот, или трансляция.

5. Молекулярные основы трансляции

При трансляции генетический текст мРНК переводится в линейную последо­вательность аминокислот полипептидной цепи белка. Поскольку продуктом трансляции является специфический белок, то процесс трансляции в равной степени можно назвать биосинтезом белка.

Процесс трансляции можно разделить на два этапа, которые имеют разную локализацию в клетке: рекогниция, или узнавание амииокислот, и собственно биосинтез белка. Рекогниция протекает в гиалоплазме, а биосинтез белка происходит на рибосомах.

Рекогниция, или узнавание аминокислот

Сущность процесса узнавания аминокислот состоит в том, чтобы соединить аминокислоту со своей тРНК. Структура тРНК обладает качествами потенци­ального «переводчика», так как в одной молекуле совмещены способности «читать» нуклеотидный текст {антикодон тРНК специфически спаривается с кодоном мРНК) и нести {на акцепторном конце) свою аминокислоту. Одна­ко соединяться со своей аминокислотой тРНК не может. Для этой цели в кле­точном соке имеются специальные ферменты, которые по существу выпол­няют роль «переводчиков», т. е. обеспечивают узнавание тРНК своей амино­кислоты,. Эти ферменты называются аминоацил-тРНК-синтетазами {сокращен­но АРСазы). Существует как минимум 2D типов АРСаз {по " Числу протеино- генных аминокислот). АРСазы — крупные молекулы {молекулярная масса 100 000—240 000), имеющие четвертичную структуру. Они специфически узна­ют тРНК и аминокислоту, катализируя их соединение по реакции

О

R—СН—СООН + НО—тРНК + Mg²- • АТФ ^APOlJ" > R—СН—C~Q—тРНК + АМФ + Н₄Р₂0₇ NHj NH₂

Для этого процесса требуется АТФ {Mg²⁺ играет роль кофактора), энергия которой используется на образование макроэргической связи в аминоацил- тРНК, т. е. в реакции происходит одновременно активирование аминокислоты •С карбоксильного конца и присоединение её к гидроксилу (З'-ОН) аденозина акцепторного конца (ЦЦА) тРНК. ■ В клетках содержится не 20 тРНК, a примерно 40—60, так как некоторые аминокислоты используют несколько специфичных для них тРНК. Из этого следует, что АРСазы обладают спо­собностью выборочно использовать при узнавании ассортимент тРНК для данной аминокислоты, т. е. ведущим звеном узнавания является аминокисло­та, а к пей подгоняется своя тРНК (или свои тРНК)

Далее тРНК путем простой диффузии переносит присоединенную к ней аминокислоту к рибосомам, где происходит сборка белка из аминокислот, поступающих в виде разных аминоацил-тРНК-

Биосинтез белка ка рибосомах

Для биосинтеза белка (второго этапа трансляции) требуются: мРНК как генетическая матрица, программа которой определяет порядок чередования аминокислот в белке; амнноацил-тРНК (для чтения «текста» мРНК и как источник аминокислот при сборке белка); рибосомы как молекулярные машины для последовательного соединения аминокислот в полипептидную цепь в соответствии с программой мРНК; ГТФ как источник энергии при синтезе белка в рибосомах; белковые «факторы», помогающие на разных фазах сборки белка в рибосомах, и, наконец, некоторые ионы как кофакторы (Mg²+, К⁺ и др.).

Что представляют собой рибосомы? Устройство рибосом прокариотов н эукариотов примерно одинаково, Отличаются они лишь молекулярной массой. У эукариотов — 80S рибосомы, у прокариотов они мельче 70S. Состоят рибосомы из двух субчастиц —- большой и малой; «скелет» каждой из них образует рРНК, окруженная белками.

acc^-MOS -» 18S рРНК + белки малой субчастииы

-»-2SS pPHK + 5S рРНК+белки большой субчастицы «(.c-^SOS-kieS рРНК+белки малой субчастииы ^ua> *60S-*23S рРНК + 55 рРНК+белки большой субчастицы

В состав рибосом входит до 60 белков, функция которых еще во многом не* выяснена. Установлено лишь одно: только в полностью " собранном виде рибо­сомы активны. Рибосомы, не участвующие в синтезе белка, легко диссоции­руют на субчастицы. В клетке рибосомы или находятся в свободном состоя­нии, т. е. в клеточном соке, или связаны с мембранами эндоплазматической сети. Свободное перемещение рибосом а различные участки клетки или соеди­нение их в разных местах с мембранами эндоплазматического ретикулума, очевидно, дает возможность собирать белки в клетке там, где это нужно.

Механизм синтеза белка на рибосомах

Синтез белка, или собственно трансляцию, принято разделять на три фазы: инициация (начало), элонгация (удлинение полипептндной цепи) и тер- минация (окончание).

Инициация. Начало трансляции — наиболее медленный процесс. В нера­бочем состоянии субчастнцы рибосом разомкнуты. мРНК, поступившая из ядра в цитоплазму, связывается с малой субчастицей на поверхности, об­ращенной к большой субчастнце. Причем точка присоединения к субчастице расположена рядом с 5'-концом РНК, так как «чтение» программы РНК всегда идет в направлении б'-*-3'. В пределах субчастицы умещаются только два кодона мРНК. Первым кодоном мРНК у 5'-конца является АУГ или ГУГ. Эти кадоны называются инициирующими, так как именно с них всегда начи­нается трансляция в рибосомах. Этим кодонам соответствует антикодон метионил-тРНК. У эукариотов имеются две разные метНОНил-тРНК. Одна нз них всегда участвует в инициации, а другая используется в процессе элон­гации. У прокариотов синтез белка начинается с формилметиоиил'тРНК, где NH₂-rpynna заблокирована формильной группой,

Кроме того, в инициации участвует как минимум три белковых фактора
инициации (F,, F₂, F₃), которые не являются составными компонентами ри­босом, и ГТФ. Белковые факторы инициации облегчают связывание мРНК с малой субчастицей и ГТФ. К этому первичному комплексу (факторы инициа­ции — малая субчастица — мРНК — ГТФ) присоединяется большая суб­частица, т. е. происходит смыкание субчастиц рибосом, после чего факторы инициации удаляются из рибосом. Необходимая для смыкания с^5частнц энергия получается за счет гидролиза ГТФ. Образовавшийся инициаторный комплекс (мРНК, рибосома и метионил-тРНК) готов к элонгации. Причем метионил-тРНК своим антикодоном специфически спаривается с кодоном АУГ мРНК, т. е. как бы «подвешивается» иа водородных связях к мРНК. а акцепторный конец, где находится аминокислота, прикрепляется к большой субчастице рибосом.

Элонгация. Рассмотрим, как происходит удлинение полипептида на одну аминокислоту (рис. 68), Синтез полипептида всегда начинается от N-конца и заканчивается С-концом. Наращивание полипептида на одну аминокислоту осуществляется в три шага:

1) связывание аминоацил-тРНК;

2) транспептидация (или перенос пептида);

3) транслокацня (или перемещение мРНК на один триплет).

Первый шаг. 6 рибосомах (как показано на рис. 68) слева находит­ся тРНК, которая антикодоном связана с кодоном мРНК, а акцепторный конец «связан» с растущим пептидом (на рис. 68 изображен дйпептид).

Этот пептид, входящий в пептидил- тРНК, связан с П-участком, кото­рый в виде белковой ниши нахо­дится на большой субчастице. В мо­мент первого шага второй кодон мРНК свободен. С ним спаривается своим антикодоном поступающая в рибосомы аминоацил-тРНК- Амино- ацильный конец этой тРНК связы­вается с А-участ'ком большой суб­частицы рибосомы. На этом пер­вый шаг, т. е. связывание, закан­чивается. На Связывание тратится энергия фосфатной связи ГТФ.

Второй шаг — транспеп- тидация — совершается таким об­разом, что происходит переброс пептидила с левой тРНК на амино­группу аминоацил-тРНК- При этом образуется пептидная связь. Ката­лизируют образование пептидной связи белки рибосом, обладающие пептидилтрансферазной активностью.

Третий шаг состоит в раз­мыкании субчастиц рибосом, на что расходуется энергия одной молеку­лы ГТФ. Пептидил-тРНК, уже несу­щая трипептид, перемещается из А-участка вместе с мРНК. с которой она спарена, в П-участок на один триплет и выталкивает свободную тРНК нз рибосом. Для синтеза одной пептидной связи (или удлинения полипептида на одну аминокислоту) затрачивается энергия двух молекул ГТФ.

Помогают элонгации так называемые белковые факторы элонгации. Элон­гация продолжается до тех пор, пока' весь текст мРНК не будет прочитан.

Термннация — окончание трансляции — зависит от присутствия в мРНК терминирующих кодонов, или «стоп-сигналов» (УАА, УГА, УАГ) и белковых факторов терминации. С терминирующими кодонами не может связаться ни одна тРНК, так как нет тРНК с соответствующими антикодонами. Возможно, что белковые факторы терминации освобождают синтезированную полипептидную цепь (рис. 69).

В клетке мРНК в синтезе белка использует не одну, а несколько рибо­сом. Такой работающий комплекс мРНК с несколькими (от 4 до 20) рибо­сомами называется полирибосомой. Благодаря образованию полирибосом нет нужды в большом числе копий мРНК. В то же время синтез белка протекает быстрее, чем при использовании только одной рибосомы. За секунду поли­пептидная цепь удлиняется на одну аминокислоту, а в интенсивную фазу роста клеток скорость синтеза нарастает до 20 аминокислот в секунду. После

отделения МРНК от рибосомы она тут же гидролизуется цитоплазматическими рибонуклеазами. Поэтому для биосинтеза тех же белков необходимо вновь • создавать мРНК-

Посттрансляционные изменения

белка

Уже в ходе трансляции белок начинает укладываться в трехмерную струк­туру, которую он окончательно принимает после отделения синтезированного белка от рибосом. Часть белков синтезируется в виде предшественников. Они подвергаются ограниченному протеолизу в цитоплазме клетки. Очевидно, обработку лротеазами проходит большинство белков, т. е. происходит их своеобразное созревание.

. Значительная часть синтезированных белков остается в клетке. Однако часть белков экспортируется из нее. Особенно •активно выделяются белки железистыми клетками, клетками печени. Как правило! экспортируются из клетки белки, которые синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазм этического ретикулума. Уже при синтезе растущая полипептидная цепь проникает через мембрану и попадает в каналы эндоплазматической сети. В цистернах эндоплазм этического ретикулума белки концентрируются. Хранение и секреция их происходят в аппарате Гольджи, где к белкам присо­единяется углеводный компонент (ставится «углеводный штамп» на пропуск из клетки); они транспортируются наружу путем экзоцитоза. Для этого требуется энергия АТФ, поэтому при дефиците АТФ белки задерживаются в клетке.

Консервация мРНК

Если необходимо сохранить мРНК, а затем вновь использовать ее генетиче­скую программу для сборки нужных белков, требуется защитить ее от дейст­вия нуклеаз. В клетках консервация мРНК происходит путем связывания ее со специальными белками цитоплазмы. Такой комплекс белка с мРНК называется информоеомой. При появлении необходимости в мРНК для син­теза белка она связывается с малой субчастицей рибосом и участвует в трансляции. Прием консервации мРНК используется в ходе развития клеток. Функционирующий ген на одной стадии развития нарабатывает продукт — мРНК, которая консервируется в цитоплазме. На следующей стадии развития ген вообще может не функционировать, а информация его тем не менее может использоваться для сборки специфических белков.

6. Биосинтез белка в митохондриях

В митохондриях имеется полная система переноса генетической информации от ДНК к белку. ДНК митохондрий сходна по размерам и кольцевой форме с бактериальной. Однако размеры ДНК и возможное количество генов в ней не позволяют кодировать синтез всех белков, находящихся в митохондриях. Очевидно, часть белков митохондрий синтезируется на собственных рибосо­мах, а часть на рибосомах цитоплазмы и затем встраивается внутрь ми­тохондрий. Какие конкретно белки синтезируются в митохондриях и какие в цитоплазме, еще остается неясным.

7. Генетический код, его свойства

Под генетическим, или аминокислотным, кодом понимают соответствие кодо- ноа (кодовых слов) определенным аминокислотам. Генетический код — своеобразный словарь, переводящий текст, записанный с помощью четырех нуклеотидов, в белковый текст, записанный с помощью 20 аминокислот. Остальные аминокислоты, встречающиеся в белке, являются модификациями одной из 20 аминокислот.

Первое кодовое слово было расшифровано Ниренбергом н Маттеи в 1961 г. Они получили из кишечной палочки экстракт, содержащий рибосомы и прочие факторы, необходимые для синтеза белка. Получилась бесклеточ­ная система для синтеза белка, которая могла бы осуществлять сборку белка из аминокислот, если в среду добавить необходимую мРНК. Добавив в среду синтетическую РНК, состоящую только из урацилов, они обнаружили, что образовался белок, состоящий только нз фенилаланина (полнфенилала> нин). Так было установлено, что кодон УУУ соответствует фенилаланину, В течение последующих 6—6 лет были определены все кодоны генетического кода.

Генетический код имеет следующие свойства.

1. Тригштность — каждой аминокислоте соответствует тройка нуклеоти­дов. Легко подсчитать, что существуют 4^Э => 64 кодона. Из них 61 является смысловым и 3 — бессмысленными (терминирующими).

2. Неперекрываемость — каждый из триплетов генетического текста не­зависим друг от друга. Ниже показана разница между перекрывающимся н неперекрывающимся кодом:

—1ШАУУУЦГА— перекрывающийся

В последнее время появились сообщения, что код иногда бывает перекры­вающимся.

• 3. Вырожденность, или избыточность, — отдельные аминокислоты имеют несколько кодонов. Об этом говорит простое сравнение: на 20 аминокислот приходится 61 смысловой кодон, т. е. в среднем каждой аминокислоте соот­ветствует около 3 кодонов. Причина вырожденности кода состоит в том, что главную смысловую нагрузку несут два первых нуклеотида в триплете, а третий не так важен. Отсюда правило вырожденности кода: если два кодона имеют два одинаковых первых нуклеотида, а их третьи нуклеотиды принадлежат к одному классу (пуриновому или пиримидиновому), то они кодируют одну и ту же аминокислоту.

Однако из этого идеального правила есть два исключения. Эю кодон АУА, который должен соответствовать не изолейцину, а метионину и кодон УГА, который является терминирующим, тогда как должен соответствовать триптофану, Вырожденность кода имеет, очевидно, приспособительное зна­чение,

4. Специфичность — каждой аминокислоте соответствуют только опре­деленные кодоны, которые не могут использоваться для другой аминокислоты.

5. Колинеарность — соответствие линейной последовательности кодонов мРНК и аминокислот в белке.

6. Универсальность — все перечисленные выше свойства генетического кода характерны для всех живых организмов. В последнее время принцип универсальности кода поколеблен ш связи с тем, что в митохондриях собствен­ный генетический код отличается от известного ранее. В нем кодой УГА соответствует триптофану, а АУА — метионииу, как того требует правило вырожденности кода. Возможно, в начале эволюции у всех простейших организмов был такой же код, как и у митохондрий, а затем он претерпел небольшие отклонения.