Лекция 9

3.7. Построение модели докинга алгоритмами генетики, табу-поиска, «отжига», метода Монте-Карло и подгонки

Генетический алгоритм широко используют при конформационном поиске с локальной минимизацией в силовых полях. Этот алгоритм имитирует (кодирует) эволюцию докинга Л_г к Р_ж

по значениям торсионных углов Л_г , условно принятых в качестве «генов», используя генетические операции, заимствованные из молекулярной биологии нуклеиновых кислот. При этом манипулируют условными «хромосомами» - набором структур и данных по их возможным конформациям комплекса лиганд-рецептор Л_г× Р_ж. На первом шаге этого алгоритма случайно строят начальное («родительское») поколение «хромосом» - структур конформеров. На втором шаге к этому поколению циклически применяют два генетических оператора - кроссинговер (комбинирует особенности двух разных «хромосом» от двух «родителей» в одной «дочерней хромосоме» потомка) и мутацию (от одного «родителя» передаётся «хромосома» со случайными вариациями в «дочерней хромосоме»). Таким образом, получают набор «дочерних хромосом»-структур, которыми подменяют старые плохие «родительские хромосомы»-структуры. Под таким давлением отбора постепенно выбираются лучшие «популяции» конформеров Л_г и Р_ж , что приводит к наиболее правильному их связыванию.

В алгоритме табу-поиска ограничиваются поиском решений только в труднодоступных для других методов моделирования конформационных областях. Легкодоступные области с уже известными конформерами попадают в запретный список – табу, т.к. для них уже найдены решения по случайному позиционированию данных ПЛВ в доступных «горячих» точках АЦ рецептора. Каждый текущий решённый шаг по новому конформеру пополняет табу-список (при условии, что новый найденный конформер оказывается лучше тех, которые уже находятся в списке). Затем весь полученный таким образом список решённых запретов подвергают процессу итерации, строя его в порядке увеличения энергии взаимодействия Л_г× Р_ж.

В методе отжига для моделирования докинга используют молекулярную динамику с случайно задаваемыми координатами атомов, торсионными углами и скоростями движения с применением повышенных температур (приём «нагрев/охлаждение»). При этом воспроизводится зависимость строения конформера от времени (через вычисление сил, возникающих на атомах в данные моменты времени по уравнению Ньютона F = m× a). Результатом является набор энергетически выгодных ротамеров (анализируют все конформеры с минимальной энергией 10 ккал/моль). Из полученного ансамбля ротамеров отбирают тот, который обладает наибольшей способностью к связыванию с биомишенью. Система Л_г× Р_ж фиксируется затем в конформации с минимальной локальной энергией.

При исследовании циклических молекул нахождение оптимальных конформеров часто осуществляют методом случайного поиска - методом Монте-Карло. В основе этого подхода лежит итерационная процедура конформационного анализа, на каждом шаге которого изучаемой молекуле произвольно задаются новые значения координат атомов или торсионных углов, а полученная при этом конформация минимизируется по энергии. Этим алгоритмом конформационное пространство исследуют с помощью, как мы видим, случайных передвижений лиганда, достигая его геометрической оптимизации для достижения минимального межмолекулярного перекрывания (минимальных стерических препятствий) конформеров Л_г и Р_ж . Проверяется также возможность перекрывания их силовых полей.

Алгоритм подгонки – это способ быстрого докинга, основанный на вычислениях стерических и электростатических комплементарностей выделенных ранее конформаций Л_г и Р_ж . В нём подгоняют структуру Л_г к доступной поверхности Р_ж по соответствию расстояний атомов лиганда к «горячим точкам» предпочтительного взаимодействия рецептора.

В целом процесс докинга-расчёта состоит из следующих стадий:

1) компьютерная подготовка структуры рецептора-белка (Р_ж) по данным РСА (удаление внешних молекул растворителей, корректировка связей, оптимизация структуры по минимальной энергии и силовым полям);

2) установление активного центра связывания в рецепторном белке (АЦ);

3) выбор арсенала лигандов (автоматический выбор по программам из баз данных и библиотек с тестированием каждого лиганда на соответствие его конформации и ориентации при помещении Л_г в АЦ; можно вручную позиционировать Л_г в АЦ, что графически выполнимо на дисплее в 3D-виде; сохранение в файле тех Л_г, которые хорошо входят в АЦ);

4) набор на компьютере параметров-дескрипторов лигандов;

5) автоматический расчёт докинга (индивидуальные и групповые расчёты);

6) анализ результатов расчёта. Подобный анализ - выборку лучших Л_г, - проводят по оценочным функциям свободной энергии связывания Л_г с Р_ж . Поскольку при этом количественно точно предсказать свободную энергию связывания (аффинность) Л_г и Р_ж нельзя (неизвестны гибкость Р_ж и роль связанной в нём воды), то выборку лучших Л_г - виртуальных хитов для экспериментальных тестов делают на основании «фильтрования» по стерическому соответствию Л_г с Р_ж .

Свободную энергию Гиббса-Гельмгольца ∆ G определяют по уравнениям:

∆ G = ∆ H - T× ∆ S = R× T× (lnK_i),

где ∆ H – энтальпия; T – абсолютная температура; ∆ S – энтропия; R – универсальная газовая постоянная; K_i - константа связывания. Эти функции делят на три группы: А) эмпирические функции. Они связывают в уравнение свойства, важные для дизайна комплекса Л_г× Р_ж и для предсказания энергии взаимодействия Л_г с Р_ж. К этим свойствам относятся ионные, полярные, Н-связи, гидрофобные и стэкинговые взаимодействия, энтропийные потери гибкости; Б) полевые функции. К ним относят молекулярные и электростатические силовые поля (без учёта энтропийного фактора); В) функции среднесиловых потенциалов. Их определяют на основе знаний данных РСА и энергий взаимодействия пар атомов Л_г и Р_ж в их комплексе.

Фильтрование по стерическому соответствию для удаления ложных положительных результатов включает отбор хитов по следующим параметрам:

1. Доля объёма Л_г , погружённая в полость Р_ж, должна быть максимальна.

2. Размер активной гидрофобной полости Р_ж должен быть минимальным.

3. Число контактов Л_г с Р_ж должно быть большим (исключая Н-связи).

4. Знания по конкретной мишени, по многим ЛП и уже решённым структурам необходимо применить (принцип консенсусного отбора).

5. Координаты докинга, полученные по первому циклу иной вычислительной программы, необходимо изучить и учесть (принцип комбинированного подхода).

6. Проводят виртуальный скрининг многих десятков тысяч хитов не по веществам, а по структурным группам (по химическому разнообразтю). Получают при этом всего несколько «сгущённых» групп структур по 1-2 тысячи веществ в каждой, что поможет резко снизить затраты на экспериментальной стадии дизайна ЛП.

7. Затем на дисплее проводят визуальный контроль нескольких лучших Л_г. Убеждаются при этом, что Л_г реально размещается в АЦ, его конформация хороша по физико-химическим параметрам и он взаимодействует с ключевыми АКО рецептора или фермента. Убирают при этом те заместители, которые выходят за пределы объёма АЦ («висят и торчат») и могут контактировать с водной фазой. Добавляют, если нужно, функциональные группы, которые лучше заполняют пространство полости АЦ, но не слишком плотно, т.к. установлено, что в последнем случае патогенные микроорганизмы быстрее вырабатывают резистентность к подобно сконструированным ЛВ.

После проведения расчётной части дизайна хитов (этап их виртуальной идентификации) и выборки из них наилучших структур (этап виртуальной оптимизации) осуществляют их лабораторный синтез, а затем экспериментальное биотестирование. Подобная процедура значительно упрощает процесс создания ЛВ, экономит время и ресурсы, затрачиваемые на успешное прохождение всего пути ЛВ от идеи до аптеки.

3.8. Дизайн фармакофора. Принцип совмещения молекулярных структур и силовых полей. ГАМКподобные нейротропные ЛП

Ансамбль разнообразных ЛВ, имеющих близкие по структуре, пространственному строению и распределению электронной плотности фрагменты, может обладать одинаковым биодействием.В таких случаях говорят о наличие в каждом из ЛВ изостеричных и биоизостеричных группировок, называемых фармакофорными. Эти фармакофорные фрагменты обязательно входят (необязательно для всей молекулы ЛВ) в трёхмерную полость рецепторного белка и взаимодействуют с его АЦ аналогичным для всего набора ПЛВ образом (см. рис. 3.8.1):

Л-------- Е¹

Л-------- Е² Э---Р_ж

Л-------- Е³

Рис.3.8.1. Взаимодействие ПЛВ, имеющих биоизостеричный трёхточечный фармакофор Еⁿ, стремяактивными точками АЦ рецептора Э---Р_ж.

Для дизайна нового фармакофора (т.е., его элементов – атомов и групп, составляющих функционально биозначимую группировку) предпочтительно знать точное строение белка и его АЦ по данным РСА или по модели его ближайшего аналога известного строения. Создание фармакофорной модели по известной геометрии АЦ происходит почти безошибочно, т.к. позволяет проследить, как ПЛВ заполняет АЦ внутри полости белка, с какими АКО взаимодействует; обозначить самые сильные связи лиганда с АЦ (ионные или Н-связи и т.п.); проверить разумность расстояний между фармакофором и окружающими его атомами АЦ. Фармакофоры представляют в виде групп и/или сил слабого взаимодействия (ниже последние указаны в скобках): центров положительного или отрицательного заряда (ион-ионные силы); кислотные группы (ион-дипольные); основные группы (диполь-дипольные силы и комплексы с переносом заряда); Н-доноры и –акцепторы (Н-связи); ароматические кольца, нейтральные гидрофобные центры и группы плоских атомов (индуцируемая поляризация, дисперсионное и стэкинговое взаимодействие); центроиды типа О-С-О и [N-C-N]⁺; ионы металлов; объёмные группы (стерическое отталкивание).

После завершения дизайна фармакофорной модели её используют для поиска в базах данных соответствующих полученной модели веществ с их качественным ранжированием по биоактивности.

Для построения модели фармакофора при неизвестной геометрии АЦ пользуются приёмом совмещения молекул исследуемых кандидатов в ЛВ, для чего анализируется набор известных биоактивных лигандов на наличие у них общих структурных черт. При этом учитываются все доступные сведения об аналогичных зависимостях ЗАС уже известных ЛВ. На первом шаге совмещают все активные лиганды по позиции, ротации и конформации. На втором шаге примеряют неактивные структуры. Построение осуществляют «ручным» (парами лигандов) или автоматическим расчётным алгоритмом (списком лигандов). Во втором случае совмещение каждой пары молекул «атом-на-атом» проводят методом наименьших квадратов, который минимизирует среднеквадратичное отклонение расстояний между парами соответственных атомов накладываемых молекул. При этом каждую пару атомов определяют заранее и в конце выявляют сходство-различие фармакофорных структур в обоих молекулах.

При малых выборках пользуются ручным методом совмещения на графическом дисплее, оценивая визуально качество подгонки к активной молекуле. В этом методе расчёт проводят только для пространственно наиболее подходящих конформеров, что упрощает и ускоряет дизайн фармакофорного фрагмента. При наложении двух молекул без построения парных атомных соответствий учитывается фактор их молекулярных полей. В этом случае молекулярное подобие распознаётся не на атомном (скелетном) уровне, а на ван-дер-ваальсовых поверхностях. Такие суперпозиции молекулярных полей основаны на зарядовой плотности молекул, их стерических объёмах и гидрофобных потенциалах. Следует подчеркнуть, однако, что АЦ неизвестной геометрии может иметь функциональную группу, которой должна соответствовать группировка, отсутствующая у испытуемого лиганда.

Для создания компьютерной модели фармакофора собирают сведения о следующих свойствах ПЛВ, необходимых лиганду, чтобы он смог связаться с АЦ рецептора:
1) о способности образовывать Н-связи, их направлении и размерах; вместо НЭП гетероатомов при этом используют фиктивный атом для подгонки совмещений;

2) о наличии планарных и гетероароматических колец, которые можно иногда совмещать по центрам колец;

3) о возможности использования вместо конформационно очень гибкой молекулы жёсткую матричную структуру, которая обладает соответствующей биоактивностью.
Типичным примером последнего подхода служит поиск новых нейротропных средств с ГАМК-подобным фармакофором. ГАМК является природным веществом и была обнаружена в головном мозгу млекопитающих в 1950. Она выполняет роль медиатора торможения при передаче нервных импульсов. ГАМК (аминолон, гаммалон) применяют при лечении нарушений нервной системы: расстройства речи, ослаблении памяти, атеросклероза мозговых сосудов, умственной отсталости у детей. Она обладает ноотропными свойствами - стимулирует обучение, улучшает умственную деятельность и память. Недавно показано, что ГАМК в определенных условиях может не

только тормозить передачу нервного импульса, но и возбуждать нейроны и служить метаболическим предшественником как тормозящих, так и возбуждающих веществ в мозгу. ГАМК синтезируется в нейроне из глутамата, выделяется в синаптическую щель и попадает на ГАМК-рецептор постсинаптического нейрона (для активизации рецептора достаточно двух-трех молекул этого нейромедиатора). Комплекс ГАМК с ее рецептором индуцирует конформационные изменения в фосфолипид-протеиновом комплексе клеточной мембраны, что приводит к открытию пор размером от 3, 7 до 6, 0 Å, достаточным для прохождения ионов хлора, которые вызывают тормозящий эффект. ГАМК является гибкой цвиттер-ионной молекулой, которая может существовать в разных конформациях. Методами квантово-химических расчетов, рентгеноструктурного анализа, изучением биодействия синтетических аналогов с жестко фиксированным строением (см. ниже полужёсткую и жёсткую модели на рис.3.8.2) и ряда природных агонистов и антагонистов ГАМК было надежно установлено, что наиболее предпочтительной для тормозящего эффекта является вытянутая конформация ГАМК (расстояние между заряженными атомами N⁺ и O^- составляет в этом случае 5, 4 ± 0, 4 Å; для свернутой конформации оно находится в пределах 4, 2-4, 7 Å).

H₃N⁺-CH₂-CH=CH-COO^- H₃N⁺-CH₂-C=C-COO^-

^{полужёсткая модель жёсткая модель}

Рис. 3.8.2. Гибкие конформеры ГАМК и её жёсткие модели.

В настоящее время изучено терапевтическое действие многочисленных производных ГАМК и ее аналогов, что позволяет гарантировать селективность центрального действия и низкую токсичность сконструированных ЛВ. При их дизайне показано, что введение различных радикалов (R¹- R⁶₎ в молекулу ГАМК приводит к значительным изменениям активности получаемых производных. Наличие атома хлора или гидроксильной группы при С-2 ГАМК (R⁶ = Cl, ОH) придает седативные и антиконвульсивные свойства этим производным, а в случае аминогруппы (R⁶ = NH₂) ГАМК-подобная активность у этого природного метаболита (который обладает, кроме того, определенной токсичностью) уменьшается. Введение по положению С-3 ГАМК гидроксильной группы (R⁵ = ОН, также метаболит) приводит к появлению противосудорожного эффекта. Этот препарат (гамибетал, буксамин) применяют в клинике эпилепсии. В случае производного ГАМК с R⁵ = Ph обнаружено седативное действие (противоэпилептический препарат фенигама), а при R⁵ = С₆Н₄Cl-p ‒ антиспастическое (лиоресал). Этерификация карбоксильной группы улучшает торможение моторной активности (ГАМК в виде эфира лучше преодолевает гематоэнцефалический барьер), но при этом увеличивается токсичность препарата. Метилирование аминогруппы (R¹ и R² = Me) или введение метильной группы по С-2 (R⁶ = Me) уменьшает ГАМК-эффект синаптического блокирования. Этот эффект совсем исчезает у амидной формы ГАМК, у g-бутиролактама и при введении в молекулу ГАМК по С-2 фенильного заместителя (R⁶ = Ph). Введение винильной группы в g-положение ГАМК усиливает её противоэпилептические свойства. Этот препарат вигабатрин ингибирует (необратимо) фермент ГАМК-трансферазу. В арсенал противоэпилептических средств вошел также габапентин, в структуре которого b-углеродный атом ГАМК входит в циклогексановое кольцо. Оказалось, что циклоалкановый фрагмент способствует лучшему проникновению препарата через гематоэнцефалический барьер. Считают, что габапентин стимулирует ГАМК-рецепторы.

В целом считается, что для проявления нейротропной ГАМК-подобной
активности у потенциального лекарственного вещества в его структуре предпочтительно иметь свободные амино- и карбоксильную группы, что связано с необходимостью создания анионного и катионного зарядов (в виде бетаина) для взаимодействия с рецептором. Некоторые заместители могут резко изменять пространственную ориентацию лекарственной молекулы относительно ГАМК-рецептора. Оптимальная длина её цепочки достигается при четырех атомах углерода с расстоянием 5-6 Å между зарядами для максимального ингибирующего действия и 3, 7-4, 5 Å - для возбуждающего эффекта. Хиральность молекулы также может играть решающую роль, так, как у 3-фенилГАМК (фенигама) активна только (S)-(+)-форма.

Раздел 4. Протеом. Функциональная протеомика. Ферменты, рецепторы и антитела как белковые макробиомишени для ЛВ.

4.1. Стуктурная иерархия протеинов.

4.1.1. Природные белокобразующие α -аминокислоты.

4.1.2. Четырёхуровневая организация белков.

4.1.3. Классификация полипептидных (белковых) биомишенией

ЛЕКЦИЯ 10

4. Протеом. Функциональная протеомика. Ферменты, рецепторы и антитела как белковые макробиомишени для ЛВ

Совокупность всех эндогенных олигопептидов, протеинов и белков, участвующих в метаболических процессах данного организма, называют протеомом данного организма. Важнейшими представителями указанных белковых молекул являются ферменты, функции которых заключаются в катализе специфических биохимических реакций, происходящих в каждом живом организме для поддержания его нормальной жизнедеятельности. Они помогают организму своевременно метаболизировать пищевые молекулы, синтезировать нужные структурные белки (например, мышечные), получать энергию для поддержания нормальной температуры тела и для движения и так далее. Нарушение функциональной активности этих жизненно важных макромолекул обычно приводит к возникновению разнообразных заболеваний у человека, что говорит о необходимости знать структуру и функции ферментов. Наука, изучающая весь набор белков организма, называется протеомикой. Протеом человека содержит около полумиллиона белков. В то же время методом РСА установлена кристаллическая структура лишь для несколько более десяти тысяч из них. Точное строение остальных функциональных белков пока не известно, что подчёркивает огромную сложность дизайна ПЛВ, которые должны взаимодействовать с ними. Напомним, что из известных типов биомишений ферменты составляют около 48% (главным образом это протеазы и киназы – около 30%; на другие ферменты приходится примерно 17%).

В цели протеомики входит: 1) идентификация всех белков данного организма и установление их строения;

2) определение пути биосинтеза каждого белка из 0.5 миллионов эндогенных белков в нём;

3) изучение места и времени экспрессии каждого эндогенного белка;

4) определение функций этих и посттрансляционных белков (тех, которые образуются в результате распада части белков под действием протеаз; в результате мутаций – замены одного аминокислотного остатка – АКО, - на другой или замены одной функциональной группы в белковой нити на другую за счёт N- или О-ацилирования; в результате добавления гема или углевода); определение пути взаимодействия этих белков в организме.

На сайтах https://www.hupo.org и https://en.wikipedia.org/wiki/Proteomics представлены данные о белках и протеомах отдельных органов в норме и при заболеваниях (мозга, печени, плазмы крови, сердца и стволовых клеток и др.); о выделении и идентификации белков, их соотношении в организме; об установлении последовательности АКО в белках и изучении их вторичных, третичных и четвертичных структурах.

4.1. Стуктурная иерархия протеинов (белков)

4.1.1. Природные белокобразующие α -аминокислоты

Аминокислоты, пептиды и протеины имеют важнейшее биологическое значение и неоценимую роль играют в поддержании жизнеспособности и здоровья человека. Для реализации этой роли природа выбрала двадцать основных α -аминокислот (АК), которые при их соконденсации образуют олигомерные протеиды и полимерные молекулы, называемые белками или протеинами. В их состав могут входить от нескольких аминокислотных остатков (АКО) до нескольких сотен и даже тысяч таких остатков (олигопротеиды и, собственно, белки). К настоящему времени установлено строение и физиологические функции многих аминокислот, олигопептидов и протеинов. Важно иметь в виду, что их свойства в большой мере определяются природой боковых заместителей в АКО – полярных и неполярных, кислотных и основных, гидрофобных и гидрофильных, алкильных, ароматических и гетероароматических. В таблице 4.1 представлены названия, структура, некоторые свойства и области применения двадцати белковых (т.е. входящих в состав белков) α -аминокислот (1-20).

Таблица 4.1

Двадцать белковых α -L-аминокислот

№ п/п	Одно буквенный символ	Название*	Трехбук-венный символ	Структура   (значение изоэлектрической точки рНi)	Применение
	A	Аланин	Ala	Ала		а
	C	Цистеин	Cys	Цис		г; лечение бронхита; добавка в производстве хлеба
	D	Аспарагиновая кислота	Asp	Асп		а, б
	E	Глутаминовая кислота	Glu	Глу		а
	F	Фенилаланин*	Phe	Фен		б
	G	Глицин	Gly	Гли		б
	H	Гистидин	His	Гис		г; противоязвенное средство
	I	Изолейцин*	Ile	Иле		в
	K	Лизин*	Lys	Лиз		Пищевая и кормовая добавка
	L	Лейцин*	Leu	Лей	исправить HOOCCH- CH CHMe2 NH (6, 0)	в
	M	Метионин*	Met	Мет		Кормовая добавка
	N	Аспарагин	Asn	Асн		Диуретик
	P	Пролин	Pro	Про	убрать 2 двойные связи!	в
	Q	Глутамин	Gln	Глн		В лечении язв
	R	Аргинин	Arg	Арг		Лечение печени
	S	Серин	Ser	Сер		Космет. добавка
	T	Треонин*	Thr	Тре		Кормовая добавка
	V	Валин*	Val	Вал		в
	W	Триптофан*	Trp	Три		в, г
	Y	Тирозин	Tyr	Тир		в

Примечания: * Незаменимые аминокислоты; а – усилитель вкуса и аромата;

б – синтез подсластителей; в – медицинское питание в виде растворов для внутривенных инъекций; г – антиоксидант.

Их подразделяют, в зависимости от свойств заместителей, на три группы: кислотные (т.е. имеющие еще одну карбоксильную группу), нейтральные (у которых нет заместителя, как у глицина, или в качестве заместителя имеется алкильная, арильная или другая слабоосновная или слабокислая группа) и основные (имеющие в качестве заместителя группировку в виде азотистого основания – аминогруппу, имидазольный радикал, гуанидильную группу). В зависимости от строения эти свойства АК отражаются на значениях изоэлектрических точек (рН_i). Последние характеризуют величины рН среды, при котором АК или иной амфолит (т.е. вещество, которое может служить как акцептором, так и донором протона) находится в водном растворе только в свободной молекулярной неионизированной форме. рН среды вне и внутри клетки влияет на ионизацию ЛВ, АК и АКО в белковых молекулах и, тем самым, на их липофильность и сродство ЛВ и АК к АКО в активном центре фермента или рецептора. АКО в АЦ белков могут иметь частично анионные формы (например, у дикарбоновых АКО 3 и 4, или у АКО 2, 16, 17, 20, содержащих тиольные и гидроксильные группы). Другие АКО могут быть протонированы и содержать катионные N⁺-формы (в случае АК 7, 9, 12, 14 и 15). Наличие равновесия в реакциях:

R-COOH < ----------à R-COO^- + H⁺

R-NH₂ + H⁺ < ----------------à R-N⁺H₃

способствует прохождению неионизированных форм через клеточную мембрану с последующей ионизацией и взаимодействием с ферментами и рецепторами. Так, у сульфометоксазола его фармакокинетика оптимальна для нейтральных форм (А), а фармакодинамика лучше для анионной формы (В):

H2N-C6H4-SO2NH-(5-methylthiazol-3-yl) + H⁺ < ---------à H2N-C6H4-SO2N^-(5-methylthiazol-3-yl) + H⁺

(A) (B)

Поэтому при дизайне ПЛВ важно получать модели при различных рН, чтобы найти оптимальную активность транспорта ЛВ и его взаимодействия с АЦ белка.

Все белковые АК – за исключением глицина (6), - обладают L-конфигурацией α -углеродного тетраэдрического атома, которая возникает при замене в глицине одного из двух протонов метиленовой группы на RCH₂- или R¹R²CH-группу. Все АК, приведенные в таблице 4.1, можно представить не только как производные глицина, но и как производные α -аланина (1), в структуре которого один или два атома водорода метильной группы замещены на группу атомов (SH, OH, Ph, COOH, CONH₂ и т.п.). Основную группу АК, как видно из табличных данных, составляют производные алифатического ряда, но некоторые АК имеют ароматический заместитель (фенилаланин 5 и тирозин 20) или гетероцикл (гистидин 7 и триптофан 19). Несколько особняком стоят производные пирролидина – пролин (13) и 4-гидроксипролин; в них аминогруппа включена непосредственно в цикл и является вторичной.

Целый ряд АК и, прежде всего не синтезируемых в организме человека, так называемых незаменимых α -L-аминокислот (5, 8-11, 17-19), должны поступать в достаточном количестве с пищей или в виде пищевых добавок. Синтетическое и микробиологическое производство диетических и кормовых АК, начатое с 1960-х годов, стало в настоящее время крупнотоннажным благодаря их широкому применению в медицине в качестве лекарственных веществ и лечебного питания, в сельском хозяйстве в качестве ростстимулирующих и кормосберегающих добавок и в пищевой промышленности в качестве вкусовых, консервирующих веществ и биологически активных добавок. Добавки природных α -аминокислот в косметику как в свободном виде, так и в виде олигомерных гидролизатов, приводит к нормализации белкового и водного баланса кожи, биостимуляции обменных процессов и в целом к оздоровлению кожного покрова. О важном практическом значении некоторых индивидуальных АК говорят следующие цифры. Ныне простейшую α -аминоуксусную кислоту – глицин, получают в количестве более 10 тысяч тонн в год; мировое производство лизина превысило 150 тысяч тонн, глутаминовой кислоты –полмиллиона тонн!

4.1.2. Четырёхуровневая организация белков

По определению аминокислоты содержат две базовые функциональные группы – аминную и карбоксильную, которые легко взаимодействуют между собой не только внутримолекулярно, с образованием бетаиновых структур (H₃N⁺-CR-COO^-), но и межмолекулярно - с выделением молекулы воды. В последнем случае возможно образование димеров, тримеров и

n-меров, в цепях которых аминокислотные остатки, несущие различные заместители, соединены между собой амидными связями -СО-NH-, называемыми в данном контексте пептидными, а:

пептидная цепь

Когда в такую цепь включено относительно немного АК, скажем от двух до нескольких десятков, то такие соединения называют олигопептидами и/или просто – пептидами (дипептид, трипептид, n -пептид). При n, равном сотням и тысячам, соединения называют полипептидами, белками или протеинами, которые имеют первичную, вторичную, третичную и четвертичную организацию. Лишь в 1950-е годы впервые удалось расшифровать первичную последовательность ряда АК в простейших пептидах. Функции природных пептидов чрезвычайно разнообразны и важны. Например, они выполняют роль межклеточных сигнальных молекул (гормоны, нейропептиды), являются базовыми веществами иммунной (самозащитной) системы организма (антитела), контролируют все биохимические реакции, происходящие в живом организме (ферменты), взаимодействуют с сигнальными интермедиаторами и передают сигналы внутрь клетки (рецепторы). В целом, человеческий организм синтезирует для поддержания своей жизнеспособности несколько сотен тысяч олигопротеинов и белковых структур, совокупность которых получила название протеома.

Олигопептиды. Выделены и охарактеризованы многообразные эндогенные олигопептиды человеческого организма: пептиды сна, нейропептиды и пептидные гормоны. Так, сон вызывается нонапептидом следующего строения: Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu. Подобные пептиды оказались очень лабильны, и их пока трудно использовать в качестве снотворных средств. Энкефалины (1, 2) и эндорфины (3, 4) являются природными опиоидными пептидами, обладающими мощным агонистическим действием на опиатные рецепторы (нейропептиды):

(1) ¹Tyr-Gly-Gly-Phe-⁵Met, [Met]-энкефалин (пентапептид);

(2) ¹Тyr-Gly-Gly-Phe-⁵Leu, [Leu]-энкефалин (пентапептид);

(3) ¹Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-⁹Pro (-¹⁰Lys), неоэндорфины (нона- и декапептиды;

(4) ¹Tyr-Gly-Gly-Phe-⁵Met-Ser-Glu-Lys-¹⁰Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-¹⁶Thr (-¹⁷ Leu), α - и

γ -эндорфины (гексадека- и гептадекапептиды).

Некоторые пептиды обладают гормональным действием. Эти гормоны синтезируются под контролем нервной системы в разных органах – гипоталамусе, гипофизе, щитовидной и поджелудочной железах, плазме крови. Они выступают, как и все гормоны других классов, в качестве химических сигналов для координации деятельности клеток, органов и в целом всего организма. Пептидные гормоны после их выброса в кровь регулируют проницаемость клеточных мембран, скорость синтеза нужных в данный момент организму ферментов и осуществляемый ими биокатализ. Важнейшими регуляторами кровяного давления являются гормональные окта- и декапептиды, названные ангиотензинами (5, 6).

(5) ¹Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-⁸Phe ангиотензин II (октапептид);

(6)¹Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-¹⁰Leu ангиотензин I (декапептид)

Они, наряду с нонапептидом вазопрессином (7) повышают кровяное давление. Гормон вазопрессин (7) синтезируется в гипофизе и регулирует кровяное давление сужением капилляров. Кроме того, он усиливает ресорбцию воды в почках.

(7)

Почки обладают эндокринной функцией и выделяют в кровь протеолитический фермент ренин, который превращает один из белков плазмы крови (ангиотензиноген) в декапептид ангиотензин I (рис. 4.1). От последнего затем ферментативно отщепляется

С-концевой дипептид, что приводит к образованию более активного ангиотензина II. Поскольку пептидные гормоны не проникают в клетку, они передают несомую ими сигнальную информацию внутрь клетки посредством связывания с рецептором, хеморецептором или ионным каналом, представляющим собой совокупность белковых или небелковых молекул.

ЛВ ЛВ

ЛВ

клеточная мембрана

Рецептор

Клетка G-белок Аденилатциклаза

АТФ ----à ц-АМФ

протеинкиназы

запуск и ускорение каскада реакций по синтезу белков

Рис.4.1. Схема образования ангиотензинов и внутриклеточного вторичного сигнала (ц-АМФ). Указаны места возможного действия антигипертензивных лекарственных веществ.Обозначения: АТГ – ангиотензиноген; АТ-I – ангиотензин I; AT-II – ангиотензин II; АТФ – аденозинтрифосфат; ц-АМФ – цикло-аденозинмонофосфат;

В данном случае гормон ангиотензин II образует с хеморецептором (R-белок) комплекс, который активирует (через внутриклеточные гуанозинтри- и дифосфатсвязывающие G-белки) фермент аденилатциклазу. Она затем ускоряет внутриклеточный синтез вторичного сигнального мессенджера – аденозин-3’, 5’-цикломонофосфата (ц-АМФ, 9) дидефосфорилированием аденозинтрифосфата (АТФ, 8). Разработаны лекарственные вещества, которые блокируют фермент, превращающий ангиотензин I в II, или служащие блокаторами ангиотензина II.

(8) (9)

Еще одним важным с точки зрения медицинского применения олигопептидом является природный антибиотик грамицидин S (10), продуцируемый споровой палочкой (Вacillus brevis). Он представляет собой циклический декапептид, обладающий бактериостатическим и бактерицидным действием и применяется для лечения ран, ожогов, воспалительных заболеваний, а также в качестве противозачаточного средства.

-[-Val-Orn-Leu-(D)-Phe-Pro-]₂- (10) грамицидин S (бактерицид)

Очень важным пептидным гормоном является инсулин (11). Он вырабатывается поджелудочной железой человека. Этот гормон регулирует углеводный обмен, способствуя превращению глюкозы в гликоген. При его недостатке в организме возникает гипергликемия (повышенное содержание глюкозы в крови) и сахарный диабет. Для эффективного гормонального контроля уровня метаболизма глюкозы необходимо ежедневное искусственное введение в организм больного инсулина, который является в настоящее время наиболее активным антидиабетическим лекарством. В состав инсулина входят две олигопептидные цепи – унэйкозапептид (цепь А) и трикозапептид (цепь В), связанные между собой двумя дисульфидными мостиками. Таким образом, он состоит из 51 АКО (молекулярная масса в целом достигает 6000). Ниже представлены строение и последовательность соединения АКО в молекуле человеческого инсулина (рис. 4.2). В ней содержится по одному остатку таких α -аминокислот, как аланин (А), аргинин (R) пролин (P) и лизин (K); по два остатка гистидина (H) и изолейцина (I); по три остатка аспарагина (N), глутамина (Q), серина (S), треонина (T) и фенилаланина (F); по четыре остатка глицина (G), глутаминовой кислоты (E), валина (V) и тирозина (Y); пять остатков лейцина (L) и шесть остатков цистеина (С), причем остатки последнего используются для связывания двух полипептидных цепей между собой дисульфидными мостиками.

ЦепьА:

Цепь В:

Рис. 4.2. Первичная структура гормона инсулина (11) человека (в скобках указаны

свободные функциональные группы концевых АКО)

Производят инсулин микробиологическим методом на штаммах E.coli с измененным геномом, в который введен синтетический ген проинсулина. Проинсулин, полученный таким образом, ферментативно переводят в человеческий инсулин, четвертичная структура которого состоит из шести идентичных по первичному строению субъединиц в виде комплекса с двумя атомами цинка.

Белки (полипептиды). Этот важнейший класс природных соединений выполняет в организме человека множество функций: из полипептидов построены стенки клеточных мембран, опорные ткани, защитные покровы, они обеспечивают мускульную работу. Круг функций протеинов еще больше расширяется за счет их способности образовывать комплексные соединения с ионами металлов, жирами, сахарами, пигментами (порфиринами) и нуклеиновыми кислотами. Но, пожалуй, главная роль белков состоит в химическом регулировании почти всех протекающих в организме обменных процессов. Белки представляют собой биополимеры, молекулярная масса которых может изменяться от нескольких тысяч до миллионов. Если разнообразие нуклеиновых кислот обусловлено возможностями чередования всего четырех азотистых оснований, то разнообразие белков создается различной последовательностью входящих в полипептидную цепь 20 аминокислот, другими словами, строением заместителей, присоединенных к цепи.

В архитектуре белков различают четыре структуры. К первичной структуре относят линейную последовательность аминокислотных остатков (АКО), соединенных в полипептидной (полиамидной) цепи индивидуальной белковой молекуле. Известны базы данных о превичной структуре трёх миллионов белков. Первичная организация белка имеет чрезвычайно важное значение в поддержании жизнеспособности человека, т.к. перестановка места в цепи даже одного остатка аминокислоты (точечная мутация нативного протеина, например, фермента) может привести к серьезному заболеванию. Важность знания первичной последовательности в них видна на следующем примере. Фермент альдегиддегидрогеназа содержит около 500 остатков АК. Если заменить остаток лизина на остаток глутаминовой кислоты, то такой фермент со слегка измененной (с точки зрения химика, а тем более биолога) структурой вдруг резко снижает свое каталитическое действие в метаболизме этаналя. Последний начинает накапливаться в организме человека, выпившего спиртной напиток, в виде ацетальдегида, который оказывает на него сильное токсическое воздействие. Именно этим объясняется повышенная чувствительность некоторых людей к пищевому алкоголю.

Белки относятся к так называемым самоорганизующимся молекулам. Это означает, что под влиянием невалентных взаимодействий между различными участками полипептидной цепи белок принимает определенную пространственную трехмерную форму, от которой во многом зависит проявление им той или иной биологической активности. Уникальная последовательность аминокислотных остатков в нитевидной белковой молекуле предопределяет ее дальнейшую самосборку с формированием вторичной, третичной и четвертичной структур. Вид этих структур зависит от строения и природы заместителей в белковой цепи – их гидрофобности, гидрофильности, нейтральности или наличия зарядов, полярности, основности или кислотности. Естественно ожидать, что между ними будут возникать различные внутримолекулярные взаимодействия – водородные связи, электростатическое отталкивание или притяжение, гидрофобное (липофильное) взаимодействие. В 1951 году, была предсказана возможность образования молекулой полипептида вторичной – локальной трёхмерной организации частей индивидуальной белковой молекулы. Дело в том, что первичная линейная структура белковой молекулы может самопроизвольно сворачиваться в спиралевидную структуру (α -структура, рис. 4.3), благодаря внутримолекулярным водородным связям (ВМВС). Подобные Н-связи возникают между Н-атомом амидной группировки n -ой аминокислоты и карбонильным атомом амидной группировки (n +4)-ой аминокислоты в одной и той же полипептидной цепи.

правая α -спираль левая α - спираль

Рис.4.3. Схема α -спирали белковой молекулы (S–шаг спирали; D-диаметр спирали; правой спиралью называют ту, которая удаляется с закручиванием по часовой стрелке, а левой – против часовой стрелки) при условии, что наблюдатель смотрит по оси спирали (по стрелке А).

В подобной спиральной структуре однотипные атомы лежат на одной винтовой линии. Для полипептидных цепей наиболее часто (до 35% всех АКО в белке) встречается правая α -спираль с шагом S равном 0.54 нм (на 10 витков формально приходится 36 АКО) с диаметром от 0.30 нм до 0.46 нм в зависимости от типа спиралеобразующего атома. Длина спирали обычно колеблется от 1.2 до 2.2 нм (включает 10-15 АКО). Часто спирали изображают в виде цилиндров или свёрнутых лент. (Дать рисунок)

Рис. 4.4.

Возможен и другой мотив вторичной структуры – складчатая листовая β -структура, которая возникает тоже за счет Н-связей уже межмолекулярных (ММВС), между несколькими линейными не спирализованными белковыми β -цепями (нитями). На них приходится до 24% от последовательности всех АКО в белке. Длина β -цепи в β -листе составляет 0.7-3.0 нм (включает 3-10 АКО). Β -Цепи изображают в виде утолщённых широких лент-стрелок. Встречается кроме того мотив супервторичной структуры, образующийся в виде петель или шпилек при взаимодействии боковых заместителей АКО со спиральными и листовыми вторичными участками глобулярных белков. В их образовании участвует примерно 33% АКО – в основном те, которые имеют полярные и заряженные боковые заместители.

Индивидуальная α -спираль может сворачиваться в глобулярное формирование, образуя уже третичную структуру, в которой гидрофобные участки находятся внутри глобулы (клубка), а полярные гидрофильные располагаются на ее поверхности. Третичный уровень структурной иерархии – это общая топологическая архитектура свёрнутой в клубок, глобулу или иную стереоформу индивидуальной белковой молекулы (субъединицы). В этом случае могут быть задействованы кроме указанных выше слабых сил и ковалентные дисульфидные молекулярные связи, стабилизирующие глобулу. Белки мышц, кожи и волос имеют фибриллярную третичную структуру, в которой несколько белковых спиралей располагаются параллельно друг другу и образуют длинную общую нить волоконного типа. Из таких фибрилл состоит структурный белок мышц миозин и кератин волос.

Наконец, четвертичную структуру могут образовывать две или несколько различных полипептидных цепи (субъединиц). Каждая из таких субъединиц в получаемой упаковке обладает своей первичной, вторичной и третичной структурами. Например, рецепторный белок нейромедиатора ацетилхолина представляет собой сложный биофункциональный агрегат, который состоит из пяти субъединиц (см. разд.?). На настоящее время установлены вторичные, третичные и четвертичные структуры более 60 тысяч белков.

Как известно (см. раздел?), в состав полупроницаемых мембран живой клетки входят кроме липидов липопротеиды и белки. Эти мембраны защищают клетку от окружающей среды и чужеродных клеток, но являются проницаемыми для пищевых молекул, которые должны поступать внутрь клетки, и для метаболических отходов, которые необходимо вывести из клетки. Структура мембраны состоит из нескольких слоев, причем в двух внешних слоях сконцентрированы белковые молекулы (на их долю приходится около 60% от массы мембраны), а во внутренних – фосфолипидные. Подобное распределение диктуется гидрофобными и гидрофильными взаимодействиями составных частей мембраны с водной средой, окружающей клетку, а также находящейся внутри нее. Большая часть заряженных и полярных группировок белковых молекул погружена в водную среду, но часть из них обращена внутрь мембраны и ассоциирована за счет водородных связей и электростатического взаимодействия с полярными «головами» фосфолипидов, неполярные «хвосты» которых ориентированы к таковым второго фосфолипидного слоя, благодаря невалентным гидрофобным взаимодействиям между ними. Ряд специальных белков пронизывают мембрану толщиной 90 ангстрем насквозь. Одни такие белки предназначены для взаимодействия с эндогенными или экзогенными веществами внешней среды и передачи внутрь клетки сигналов об их появлении. Другие белковые молекулы, образуют каналы, высокоизбирательно пропускающие внутрь клетки и из нее биологически важные органические молекулы и неорганические ионы К⁺, Na⁺, Ca²⁺. Тем не менее, одной из самых главных функций белков является биокатализ. Белки, выполняющие эту функцию, называют ферментами.

4.1.3. Классификация полипептидных (белковых) биомишенией

Белковые биомишени по их биологическим функциям подразделяют на три группы: 1) ферменты; 2) рецепторы; 3) антитела. Белковые биомишени по семействам классифицируют на четыре группы: А) имеющие аналогичные участки в первичной организации белка (близкие последовательности АКО); Б) имеющие специфические мотивы – непрерывные фрагменты в последовательности АКО, характерные для уже известных семейств; В) имеющие аналогичные участки во вторичной структурной организации белка (α -спирали, β -листы, шпильки, неупорядоченные фрагменты, особенно в области АЦ); Г) имеющие аналогичную аффинность (сродство) к данному набору и характеру ПЛВ. В последнем случае вместо аффинности, которую прогнозировать затруднено по свободной энергии связывания с лигандами, используют описание сродства на основе дескрипторов межмолекулярного взаимодействия – электростатические, диполь-дипольные, Н-связей, дисперсионных сил и гидрофобных контактов.

Лекция 11

4.2. Ферменты. Их каталитические функции. Активные центры ферментов. Коферменты

4.2.1.Ферменты и их функции

4.2.2. Коферменты.