Распознавание и виды взаимодействия РБ с ЛВ

Рецептор и ЛВ должны распознать друг друга на «дальнем» расстоянии перед тем, как начать «тесно» взаимодействовать между собой. Объектами химического распознавания на молекулярном уровне и последующего взаимодействия ЛВ и его фармакофора с биосистемой могут быть не только биорецепторы и ферменты (они являются биомишенями 80% всех ЛВ), но и клеточные мембраны, нуклеиновые кислоты, эндогенные регуляторные молекулы (нейромедиаторы, гормоны и т.п.). В акте дальнего узнавания РБ и ЛВ решающее значение имеют трёхмерные электростатические поля, которые окружают каждого партнёра-участника (рис. 14.1). В молекулярном моделировании имеются методы расчёта молекулярных электростатических потенциалов (МЭП), которые являются основным параметром для изучения подобных взаимодействий.

ЛВ АЦ РБ

Рис. 14.1. Акт дальнего распознавания партнёров электростатическими полями перед образованием комплекса РБ с ЛВ.

После акта дальнего распознавания происходит сближение участников и вступают в межмолекулярное взаимодействие их заряды, диполи, Н-связывание и гидрофобность отдельных фрагментов. Очевидно, что для возникновения близких контактов между партнёрами они должны иметь химическую, структурную и стереоспецифичную комплементарность соответствующих друг с другу фрагментов. Вызывающее биоэффект взаимодействие между ЛВ и его биомишенью происходит через единый комплекс, благодаря возникновению между ними слабых (но их много!) нековалентных связей. Образование такого комплекса, как правило, обратимый процесс и в нем могут участвовать слабые силы четырёх типов. К первому типу межмолекулярного взаимодействия относятся силы электростатического взаимодействия, которые возникают между участками, имеющими ионные заряды и/или постоянные диполи, которые образуются благодаря различию в электроотрицательности двух связанных между собою атомов. Например, связь между катионом аммонийного типа ЛВ и анионом депротонированной карбоксильной группы АКО аспарагиновой или глутаминовой кислот в АЦ РБ (энергия связи 20-40 кДж/моль) называют ионной. Ниже на рис.14.2 приведен пример ионного типа взаимодействия ЛВ пивагабина (1) в анионной форме с заряженным гуанидиновым фрагментом аргининового остатка АЦ РБ:

Ме-С-С-N-CH₂- CH₂ -CH₂-C - + C-NH ---- Arg

(1)

Активный центр рецепторного белка

Рис. 14.2. Ионный тип взаимодействия ЛВ пивагабина (1) с активным центром РБ.

Связь между ионом и диполем называют ион-дипольной. Энергия связи за счет сил ион-дипольного взаимодействия составляет 10-25 кДж/моль, а силы диполь-дипольного взаимодействия могут формировать связи с энергией 4-10 кДж/моль. Напомним, что все связи между углеродом и более электроотрицательными гетероатомами асимметричны по распределению электронной плотности связывающих их электронов, т.е. эти связи постоянно поляризованы (диполярны): Это приводит к взаимодействию диполя с ионами или с другими диполями:

^+δ Cà N^-δ , ^+δ Cà O^-δ , ^+δ Cà S^-δ , ^+δ Cà Hal^-δ ;

^+δ C=N^-δ , ^+δ C=N^-δ , ^+δ C=O^-δ , ^+δ C=S^-δ

Это приводит к взаимодействию диполя с ионами или с другими диполями, например, в случае взаимодействия двух дипольных участков снотворного ЛВ (2) – залептона, - с ионной и дипольной группами остатков аспарагиновой кислоты и серина АЦ РБ (рис. 14.3):

Me-C-N C=N ЛВ залептон (2)

O O O-H

Активный центр рецептора

Рис. 14.3. Ион-дипольное и диполь-дипольное взаимодействие ЛВ залептона (2) с АЦ РБ.

При сильном диполь-дипольном взаимодействии между диполями возможен частичный перенос электронной плотности – в таком случае говорят о координационном донорно-акцепторном взаимодействии с образованием комплекса с переносом заряда (КПЗ). При этом донорный диполь имеет группы с избыточной p-электронной плотностью и атомы с парой несвязанных электронов, а акцептор – группы с p-дефицитной плотностью или катион металла в ЛВ координационного типа или в белковой системе. Стабильность КПЗ зависит от потенциала ионизации донора и от сродства к электрону акцептора. В качестве примера образования КПЗ на рис.14.4 показано сильное диполь-дипольное взаимодействие двух сильно поляризованных безольных ядер - фунгицида хлороталонила (3) с остатком тирозина в АЦ РБ:

Рис.14.4. Образование КПЗ между фунгицидом (3) и тирозиновым АКО АЦ РБ.

Второй тип слабых сил объединяет индуктивные силы. Подобные слабые силы возникают в двух случаях. Во-первых, они могут появляться между двумя партнёрами, один их которых, имея заряд или большой дипольный момент, поляризует своим электрическим полем первоначально неполярную молекулу второго партнёра, перераспределяя в ней электроны. В результате благодаря наведённому таким образом (индуцированному при тесном контакте) диполю между двумя партнёрами появляется ион-дипольное индуцированное взаимодействие. Во втором – универсально действующем случае, - в любых неполярных и гидрофобных молекулах и их фрагментах постоянно возникают и мгновенно исчезают градиенты в стандартном распределении электронов. Это случайное наведение непостоянных микродиполей за счёт, например, броуновского движения электронов, приводит к возникновению в ан-дер-ваальсовых (дисперсионных) сил, которые относятся к диполь-дипольным микровзаимодействиям, носящим универсальный.

К третьему типу слабых сил относят водородные связи, которые возникают, например, между молекулой-донором Н-атома (группой ОН или NH) и молекулой-акцептором этого Н-атома (гетероатомом Х, имеющим неподеленную пару электронов. В результате подобного взаимодействия, имеющего диполь-дипольный характер, образуется ансамбль из указанных двух разных молекул (донор-О^…Н^{+δ …}: Х-акцептор). Это приводит к взаимодействию диполя с ионами или с другими диполями. Энергия Н-связи колеблется от 12 до 20 кДж/моль. Н-Связи играют чрезвычайно важную роль в формировании вторичных структур ферментных и рецепторных белков, а также в двойных спиралей носителей наследственности – ДНК (рис.14.5):

Рис.14.5. Роль Н-связей (показаны пунктиром) в формировании белковых моноспиралей (а) и листов (б), а также двойных спиралей ДНК (в).

Четвёртый тип сил - слабые силы гидрофобного взаимодействия, которые возникают между липофильными неполярными группами ЛВ и рецептора в водной среде, в которой молекулы воды, отталкивая гидрофобные участки ЛВ и РБ, разупорядочиваются (рвутся старые Н-связи) и перестраиваются в другой порядок (формируются новые Н-связи). При этом неполярные липофильные группировки (цепи, кольца) молекул лиганда словно выталкиваются из окружающих их молекул воды водной фазы, сближаются и прижимаются друг к другу (рис.14.6), что приводит к более компактному взаимному расположению гидрофобных зон ЛВ и РБ (в соответствии принципу “подобное с подобным”).

…H-O-H…H-O-H…H-O-H…H-O-H… H-O-H…
Анестетик (4) H2N - -COO-CH2-CH2-CH2-CH3

…H-O-H…H-O-H…H-O-H H3C-CH2-CH--- Ile

H-O-H…H-O-H… CH3

Рис.14.6. Образование комплекса анестетика бутамбена (4) с изолейциновым АКО в АЦ РБ за счёт гидрофобных сил.

Подобные силы способствуют также интеркаляционной и стекинговой самоорганизации между ЛВ и биомишенью или ее фрагментами. Считается, что при этом энтропия системы увеличивается, а свободная энергия Гиббса уменьшается, что в целом стабилизирует комплекс РБ·ЛВ. Все рассмотренные слабые силы могут действовать между ЛВ и рецептором одновременно (кооперативно) и сообщать образующемуся комплексу значительную для проявления биоактивности стабильность.

Реакция РБ с ЛВ с образованием комплекса РБ·ЛВ обратима. Устойчивость комплекса измеряется константой его диссоциации К_д, меньшее численное значение которой указывает на большую концентрацию комплекса и, следовательно, на его большую устойчивость.

РБ + ЛВ < ---------- РБ·В; К_д = [РБ]·[ЛВ]/[РБ·ЛВ]

Теории взаимодействий ЛВ с белками. В первой из них предполагалось, что уровень биоактивности прямо пропорционален числу рецепторов, которые оказались занятыми молекулами ЛВ с образованием комплексных супермолекул. При этом были введены такие термины, как взаимное сродство или аффинность ЛВ и РБ, т.е. мера способности каждого из них связываться друг с другом, зависящая от их молекулярной комплементарности, и выражаемая через рК_d (от 10 до 1). Другим важным показателем считали эффективность действия ЛВ (α), т.е., способность образующегося из ЛВ и РБ комплекса инициировать полезный лечебный биоотклик в организме. Эту присущую данному ЛВ биоактивность α измеряется в процентах от 0 до 100 (или в долях единицы от 0 до 1). Максимальный отклик в 100%, индуцируемый организмом после введения в него дозы ЛВ, свидетельствует, что данное ЛВ является полным агонистом, т.е. ксеновеществом, добавление которого к тест-объекту вызывает такой же биоотклик, как эндогенное вещество-метаболит. В таком отношении представляются синтетическое вещество карбахолин (холиномиметик) и природный нейротрансмиттер ацетилхолин (см. раздел 4.3.2.1, рис.1). В остальных случаях проявления биоактивности (1-99%) имеют дело с парциальными агонистами. В противоположность агонисту антагонистом называют любой ксенобиотик, при добавлении которого к тест-объекту, во-первых не наблюдается биоотклик, а во-вторых, отклик не возникает даже при дальнейшем добавлении к этой смеси природного эндогенного метаболита, который в отсутствии антагониста вызвал бы ожидаемый отклик. В случае неконкурентного антагониста отклика не получают при любой, даже очень высокой, концентрации эндогенного вещества. Конкурентным антагонистом называют ЛВ, в присутствии которого при очень высокой концентрации

добавляемого эндогенного вещества начинает проявляться биоотклик. На рис. 14.7 приведены графики зависимости эффективности (α) от вводимой в биотест-объект дозы ЛВ (концентрации ЛВ) при одинаковом и разном сродстве ЛВ к РБ:

Рис.14.7. Кривыезависимости эффективности действия ЛВ (α) от вводимой в биотест-объект дозы ЛВ (концентрации ЛВ) при: а) одинаковом и б) разном сродстве(рК_d) ЛВ к РБ.

В другой теории взаимодействия считается, что биоактивность зависит только от числа соударений молекул ЛВ с РБ в единицу времени и от скорости их совместной ассоциации в комплекс и диссоциации этого комплекса и не зависит от числа РБ, связанных в комплексы. Если скорость ассоциации больше скорости диссоциации, то мы имеем дело с агонистом, а в противном случае – с антагонистом. В теории индуцированной комплементарности ЛВ к РБ добавляется учёт возможности их взаимной и обратимой конформационной подстройки друг к другу с тем, чтобы ЛВ могло свободнее входить в АЦ РБ, как «ключ к замку» (рис.14.8).

Рис. 14.8. Индуцируемое изменение конформации РБ: А) конформация до распознавания ЛВ; Б) конформация, изменённая при сближении с ЛВ.

Тогда их комплекс и конформация, индуцируемая в нём, эффективнее передают сигнал на биоотклик. Считается, однако, что не всякий комплекс ЛВ и РБ активен и что между активными и неактивными формами существует обратимое равновесие.

ЛЕКЦИЯ 15

15.1. Модельный поиск ПЛВ агонистов для внутриклеточных ядерных рецепторов (ЯРБ).

В этом разделе рассмотрены результаты модельного поиска новых ПЛВ агонистов для РБ другого типа – не мембранных, а внутриклеточных ядерных рецепторов (ЯРБ). Было установлено, что они связываются с ДНК, являются факторами транскрипции и участвуют в регулировании экспрессии генов, системы метаболической защиты (на уровне экспрессии метаболических ферментов типа CYP2B при ксенобиотических стрессах), репродукции, дифференциации клеток и гомеостазе. Потенциальные активаторы семейства этих ЯРБ интересны для лечения холестаза и желтухи новорождённых.

Виртуальный скрининг для поиска лигандов-активаторов для такого ЯРБ, как конститутивно-активный андростановый рецептор человека (CAR, открытого в 1994 г. в цитоплазме), был осуществлён на 85 тысячах веществ по модельным данным докинга, полученным для эталонных агонистов-активаторов CAR, - по клотримазолу (5) и трис-(4-метилфенил)фосфату (ТМРР, 6):

(5) клотримазол (6)трис-(4-метилфенил)фосфат (ТМРР)

Модель самого рецептора построена по гомологии. Из всего арсенала веществ соответствовали полости связывания с АЦ CAR и удовлетворяли правилу Липинского около 10 тысяч ПЛВ нестероидного строения. На отобранных ПЛВ затем провели молекулярный докинг в кристаллическую (по данным РСА) и модельную структуру АЦ CAR (по программе GOLD –генетический алгоритм поиска, - и оценочной функции GoldScore). Для каждого эталона анализировали по 30 конформаций, с которыми проводили процесс докинга в гидрофобную полость АЦ ЯРБ (по модельной структуре и по данным РСА). В результате получены два схожих типа связывания (рис. 15.1 и 15.2):

Рис.15.1. Докинг клотримазола (5) в гидрофобную полость АЦ ЯРБ (по модельной структуре и по данным РСА)

Рис.15.2. Докинг трис-(4-метилфенил)фосфата (ТМРР, 6).

Клотримазол (5) связан глубоко в полости АЦ и взаимодействует своими ароматическими ядрами с таковыми АКО 224, 234, 161 и 326. Его ван-дер-ваальсово взаимодействие с АКО L 338, принадлежащим спирали домена AF-2, который не входит в АЦ, незначительно из-за гидрофобного барьера четырёх АКО – F 234, F 161, Y 326 и N 165. Последние, однако, взаимодействуют со спиралью домена AF-2, поддерживая её активность.

Другой агонист - ТМРР (6), - расположен ближе к домену AF-2 и взаимодействует с ним за счёт сближения его толильной группы с АКО домена I 346. Фосфатная группа образует стабильные Н-связи с N 165 и Y 326 даже при моделировании других конформаций, тогда как F 161 подвижен, что позволяет АЦ связываться с другими ПЛВ, в частности по гидрофобным участкам:

Объём полости активная (АК) неактивная (НАК)

конформациях

Гидрофобные

участки

Рис. 15.3. Докинги неизвестных веществ в активной (АК) и неактивной (НАК) конформациях.

По результатам докинга двух известных агонистов и 10 тысяч неизвестных отобрано 60 веществ активных, а из них 17 новых хитов-агонистов ЯР. Кроме того найдено хиты трёх новых классов – N-моно- и N, N-дизамещённых арилсульфонамидов.