Коферменты

Наряду с чисто белковыми ферментами существует множество ферментов, в состав которых кроме белка (апофермента) входит и небелковая часть, называемая коферментом (в случае нуклеотидов или витаминов) или кофактором (в случае ионов металлов). В отдельности апофермент, кофермент и кофактор могут лишь в незначительной степени катализировать биореакции. Будучи же в комплексе, они ускоряют метаболические процессы на несколько порядков. Коферменты могут быть связаны с белковой частью слабыми нековалентными взаимодействиями или же достаточно прочно – ковалентной связью через сульфидный или дисульфидный мостики (в этом случае кофермент называют простетической группой). Установлено, что коферменты обеспечивают селективность связывания превращаемого субстрата в комплекс с ферментом. Роль же апофермента заключается главным образом в пространственной организации всего биохимического процесса. Кофермент или кофактор размещаются обычно в углублениях апофермента, создавая активный центр.

Более 200 ферментов проявляют активность лишь в присутствии кофермента, а несколько сотен ферментов содержат кофакторы, которые связаны с белковой частью координационной связью.

Общеизвестно, что для нормального развития всем живым организмам требуются микроколичества различных металлов. К числу таких «металлов жизни» (помимо широко распространенных элементов первой группы периодической системы Менделеева – натрия и калия, а также элемента второй группы – кальция) относятся и несколько более экзотичные микроэлементы – железо, цинк, магний, медь и некоторые другие, которые входят в состав ферментов. Все они находятся в организме в виде катионов, координационно связанных с органическими лигандами (основаниями – аминогруппами, гидрокси- и меркаптогруппами аминокислот, а также с азотистыми гетероциклами, в первую очередь с азинами и азолами). Микроэлементы второй группы (магний и цинк) входят в состав рекордного числа ферментов. Так, ионы магния содержатся в 300 биокатализаторах. Кроме того ионы магния нужны для уменьшения возбудимости нервной системы и мышц (сердечных и глазных). В организме человека постоянно содержится от 25 до 40 г ионов магния, что должно обеспечиваться их суточным приемом в 0.2 – 0.3 г. Цинк является кофактором более 40 ферментов, в частности, в ряде ферментов, контролирующих гидролиз белков (в гидролазах) и синтез нуклеиновых кислот (в полимеразах). Установлено, что в случае пищеварительной карбоксипептидазы А ион цинка удерживается в активном центре, благодаря координационным связям с двумя атомами азота двух имидазольных ядер остатков гистидина-69 и -196, и образованием ионной связи с карбоксильной группой глутамата-72. Поскольку для цинка характерно координационное число 4 (sp³-конфигурация), его остаточная связь ориентирована электрофильно на С-концевую карбоксильную группу гидролизуемого белка. Суточная потребность организма человека в цинке достигает 20 мг. В мышцах человека сосредоточено две трети ионов цинка от его общего количества (в среднем 2 г) в организме.

Очень важную роль в обеспечении жизнеспособности человека играет элемент восьмой группы – железо. Этот микроэлемент входит в состав гемопротеидов гемоглобинов и цитохромов, в которых его ионы связаны в виде гемов. В составе ферментов цитохромов ионы железа участвуют в переносе электронов с органических субстратов на кислород (цитохром с) или окисляют (гидроксилируют) ксенобиотики, увеличивая их растворимость и скорость выброса из организма (цитохром Р 450).

В состав ряда окислительно-востановительных ферментов входят также селен (в виде аминокислоты – селеноцистеина) и медь. Например, медьсодержащая цитохром с оксидаза катализирует окисление восстановленной формы цитохрома с. В организме человека ее содержится до 150-200 мг (суточная доза до 5 мг). Уместно указать, что ядовитость таких металлов как As, Cd, Hg и Pb связана с тем, что они в ионной форме образуют комплексы с ферментами и обратимо ингибируют их каталитическую активность. При своевременном принятии антидотов эти комплексы разрушаются, металлы-токсиканты быстро выводятся из организма человека в виде более прочных комплексов с молекулой антидота и ферментативная активность восстанавливается.

Большинство коферментов представляют собой производные азотистых гетероциклов. В таблице 4.2 представлены главные коферменты, их структура, витаминные предшественники и частицы, переносимые в биохимических реакциях, контролируемых этими биокатализаторами.

1.

Таблица 4.2.

Некоторые коферменты и их витаминные предшественники

№	Название кофермента	Название структурных фрагментов	Витаминный   предшественник предшественник	Переносимые частицы
	Никотинамидадениндинуклеотид (НАД+), R=H	Пиридин*, тетрагидрофуран, адениндифосфат	Никотиновая кислота (витамин В5)	Водород и электроны
	Никотинамидаденинди- нуклеотидфосфат (НАДФ+), R=PO3H2	То же, трифосфат	То же	То же
	Флавинмононуклеотид (ФМН), R=PO3H Me Me N CH 2 (CHOH) 3 CH 2 OR N N O O NH	Изоаллоксазин*, фосфат	Рибофлавин (витамин В2) R=H	То же
	Флавинадениндинуклеотид (ФАД)	Изоаллоксазин*, аденин, тетрагид- рофуран, дифосфат	То же	То же
	Тиаминпирофосфат (кокарбоксилаза)	Тиазол*, пиримидин, дифосфат	Тиамин (витамин В1), R=H	Альдегидная группа
	Кофермент А (КоА) (Структура см. разд.?)	Аденин, дифосфат, пантотеновая кислота, меркаптоэтиламин*	Пантотеновая кислота, (витамин В3, см. разд.?)	Ацетильная группа
	Кобамидный кофермент	Полигидропорфирин*, бензимидазол, аденин	Кобаламин (витамин В12)	Метильная группа
8.	Пиридоксальфосфат (ПФ), R= PO3H	Пиридин*	Пиридоксаль (витамин В6,), R= H	Аминогруппа
	Биотин (кофермент R)	Тетрагидроимидазол*, тетрагидротиофен, пентановая кислота	Биотин (витамин Н)	Диоксид углерода

* - отмечена активная часть кофермента.

Как видно из таблицы, коферменты могут служить переносчиками электронов и атомов водорода (коферменты 1-4), ацильных групп (5, 6), алкильных групп (7), аминогрупп (8), а также и ряда других частиц.

4.2.3. Определение активного центра (АЦ) известного белка

После определения белка-мишени устанавливают его первичную структуру, когда и как он экспрессируется и какова его метаболическая судьба. Для установления правильной последовательности АКО в цепи белка и выявления его АЦ надёжнее всего получить данные РСА самого белка и конформацию ЛВ в его комплексе с этим лигандом. Тем не менее остаются определённые трудности даже при получении данных РСА, что связано с невозможностью иногда локализовать атомы водорода, а электронная плотность даётся в основном для не водородных атомов. Точность значений индикатора теплового движения атома (В-фактор) не всегда достаточно высока, и хорошее разрешение достигается лишь при значениях менее одного ангстрема (при значениях от 1 до 2Å можно получить только форму функциональной группы, а при разрешении в 3Å структура слишком размыта). Если по РСА может быть разрешена вся структура белка, то при использовании 2DЯМР последовательность АКО устанавливают только в локальных участках белка. Применение ядерного эффекта Оверхаузера (NOE) позволяет рассчитать межъядерные расстояния (границы геометрии АЦ белковой молекулы) с последующей оптимизацией положения атомов по силовому полю.

4.2.4. Дизайн АЦ белка неизвестной структуры по методу гомологии

На третьем этапе проводят попарное и множественное выравнивание последовательностей (соответствий) АКО в консервативных сегментах шаблона и изучаемой неизвестной мишени (программы GAP и MAXHOM). Это даёт основу для следующего этапа – дизайна консервативных областей моделируемой неизвестной мишени с использованием координат шаблона, переносимых на модель наложением структур. Это процедура уточняется итерационными операциями с применением метода наименьших квадратов. Далее (5-й этап) следует дизайн вариабельных сегментов конструируемой модели. Он усложнён наличием многочисленных вставок АКО и/или их опущением в изменчивых последовательностях, особенно в петлях. Если две петли в моделируемом белке и гмологичном шаблоне имеют одинаковые или аналогичные длину и последовательность АКО, то конформационно обе петли будут схожи. Если же есть существенные различия, то ищут подобные сегменты у других шаблоновили же создаётся петля по заданным геометрическим параметрам. После имитации основной цепи последовательностей АКО мишени приступают к шестому этапу моделирования – построению боковых цепей в биомишени. Здесь предсказывают главные конформации заместителей, которые отвечают минимуму поверхности потенциальной энергии с учётом локального окружения. Иногда прибегают к ручной подгонке конформаций, особенно при участии АКО в специфических взаимодействиях, таких как образование Н-связей, S-S-мостиков и протонировании.

В конце процесса моделирования АЦ мишени (7-й этап) оптимизируют трехмерную (вторичную) структуру модельной мишени на основе минимизации энергии и молекулярной динамики локальных конформационных пространств. На этом этапе у окончательной модели должны быть сняты стерические напряжения и учтена возможность «плохих» (близких) ван-дер-ваальсовых контактов между АКО и/или Н-атомов.

Таким образом гомологическими методами - на основе знаний структуры белка-шаблона, - прогнозируется модель вторичной структуры биомишени у ферментного, рецепторного белка или белкового антитела.

4.2.5. Дизайн распознавания и межмолекулярных взаимодействий ПЛВ с ферментами. Кооперативность энергий слабых нековалентных взаимодействий при образовании комплексов ПЛВ/фермент. Ингибиторы ферментов

В межмолекулярном распознавании, взаимодействии, связывании и образовании комплексов ПЛВ с АЦ ферментов и рецепторов определяющую роль играют их электростатические потенциалы, энергии сольватации, энергии их межмолекулярного взаимодействия и энергии гидрофобных полей. Для построения конечной модели белка, для прогноза и картирования их взаимодействий с ПЛВ созданы программы, по которым рассчитывают указанные выше энергетические характеристики. В прогнозе модели белка учитывают также статистические (на основе знаний того, что по статистике во всех белках 90% остатков Ala, Arg, Gln, Glu, Met, Leu и Lys предпочтительно образуют α -спирали, а 90% Cys, Ile, Phe, Thr, Trp, Tyr и Val образуют β -листы и шпильки) и стереохимические методы. Окончательное пространственное распределение тысяч атомов устанавливается расчётами по методам молекулярной механики (МММ) или молекулярной динамики (ММД). По МММ (эмпирическому, в отличие от квантовомеханического, расчёту энергии атом-атомных взаимодействий для создания приближённых моделей) определяют силовые поля белка и электростатические взаимодействия (по закону Кулона с использованием уравнений Пуассона-Больцмана (УПБ), учитывающих диэлектрическую проницаемость и эффекты растворителей). Обычно при этом используют эмпирические приёмы, в которых заряды описывают как точечные в центрах атомов. Причём заряды считают не по всему белку, а по малым фрагментам – по конкретным АКО, особенно расположенным в АЦ. Эти данные уже собраны в библиотеках АКО. По методу (ПБ) глобулу белковую рассматривают как 3D-структуру с точечными зарядами, разделённую на две отдельных диэлектрических области, а её поверхность представляют как границу между ними. Внутренняя часть глобулы моделируется как растворённое вещество, а всё, что снаружи поверхности глобулы – как растворитель.

По ММД определяют конформационные изменения (подвижность биомолекулы в окружении растворителя) при связывании ПЛВ с белком и укладки цепей. Алгоритмом МММ решают классические уравнения движения механики Ньютона, которые связывают конформационную подвижность макромолекулы, состоящей из большого числа атомов, с массой каждого атома, его радиусом-вектором, силой и временем её действия на атом и, наконец, с классическим полем, которое определяется координатами всего ансамбля задействованных атомов. При моделировании траектории движения в системе поддерживаются определённые условия по давлению и температуре. Использованием методов «отжига» при температурах 300-400К или ниже избегают геометрических обращений амидной связи. На выходе получают координаты атомов системы, их скорости в зависимости от времени и энергию взаимодействия молекул (потенциальное поле). Пример программы GROMACS находится по адресу https://www.gromacs.org. Полученные данные проверяются на: планарность пептидной связи, ароматических и гетероароматичеких заместителей; предпочтительность её транс -конфигурации (допустимо лишь 5% цис -формы); хиральность атомов и цепи (только L-конфигурация АКО в белке и α -спираль правой конформации); длины и углы связей в цепи (торсионный угол C_α -N-C¹-C^β каждого АКО лежит между 23^о и 45^о).

Качество и достоверность полученной модели белка (её валидация) подвергаются затем сверке по программам на соответствие следующим свойствам («индексам качества»): 1. Упаковка модельного белка должна быть очень компактна и упорядочена – не должна иметь зазоров между спиралями и листами при плотности глобулы, сопоставимой с плотностью малых молекул. 2. Отсутствие слишком плотных ван-дер-ваальсовых контактов. 3. Поверхность глобулы как правило гидрофильна и содержит до 27% гидрофильных заряженных и полярных АКО (Asp, Glu, Lys, Arg). 4. Внутренность ядра глобулы плотна, не имеет больших полостей, преимущественно гидрофобна и в ней преобладают АКО с неполярными боковыми заместителями (Val, Leu, Ile, Phe, Ala, Gly – до 63%). 5. В области АЦ возможны его различные формы, в том числе индуцируемые связыванием с ПЛВ, аллостерическим окружением (наличием не активных, но связывающих участков белка), которые могут даже привести к закрытию АЦ белковой частью. Квантово-химические расчёты по оптимизации геометрии исходных ПЛВ и АЦ, по кинетике их взаимодействия, по переходным состояниям их структур и реакционным координатам атомов и/или электронов, а также по энергиям перехода от взаимодействующих молекул к их комплексу (при учёте ван-дер-ваальсовых объёмов) могут указать на индуцируемые изменения формы АЦ. Имеются программы по компьютерному автоматизированному поиску в моделируемом белке щелей, карманов, канавок и других полостей в сравнении с компьютерными данными по АЦ уже известных белков. При этом предполагается, что найденная у моделируемого белка полость будет для него АЦ. Последующее симулирование молекулярной динамикой позволяет контролировать аллостерическое окружение АЦ и изменение конформаций ПЛВ и АЦ при их взаимодействии. В самом моделируемом АЦ путём сравнения с известными белками определяют все ключевые АКО. Построением матриц расстояний между идентичностями последовательностей АКО в АЦ и матриц сходства АКО (или битовых строк) можно классифицировать семейства белков по их АЦ или по анализу их консервативных участков АКО.

Ингибирование ферментов. Монооксид азота (NO) оказывает лечебное действие, расслабляя гладкие мышцы кровеносных сосудов и желудочно-кишечного тракта, снижая кровяное давление и снимая ишемические боли сердца. NO является эндогенной молекулой с функциями сигнала межклеточного взаимодействия. Эта сигнальная молекула образуется в организме эндогенно из аргинина ферментом NO-синтетазой:

Монооксид азота выполняет в организме роль нейромедиатора, развивает иммунные реакции (антимикробные, противораковые и др.) регулирует деятельность мочеполовой системы, участвует в системе долговременной памяти и стимулирует эрекцию полового члена. За это открытие ученым была присуждена Нобелевская премия в области медицины за 1998 год. Интересно, что в том же году вещество (49) получило медицинское применение для лечения сексуальной дисфункции – ослабления эрекции мужского полового члена. Этим видом импотенции страдают более 150 млн мужчин в мире. Производное пиразолопиримидина (49) быстро приобрело популярность под названием виагры и уже через четыре года сумма его продаж в мире достигла почти два миллиарда долларов, а вскоре был ещё один препарат аналогичного действия (50):

Следует отметить, что пиразолопиримидин (49) был сначала синтезирован в целях борьбы с гипертензией и ангиной, с тем, чтобы он ингибировал сердечную фосфодиэстеразу-5. Однако на второй стадии клинических тестов он не показал нужного уровня ожидаемой активности, но пациенты мужского пола при его приеме испытывали повышенную способность полового члена к эрекции. Это наблюдение стало основой для внедрения тестируемого вещества на фармацевтический рынок в качестве стимулятора эректильной активности. Виагра усиливает выброс и расслабляющее действие монооксида азота (активирующего гуанилатциклазу – ГЦ) на гладкие мышцы сосудов в половом члене, что резко улучшает его кровоснабжение и, следовательно, эрекцию. Нормализация эректильной функции происходит благодаря тому, что виагра ингибирует фофсодиэстеразу (ФДЭ), которая участвует в гидролизном дезактивировании циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ, 51). При повышении концентрации цГМФ (51) снижает уровень кальция внутри клетки, что приводит к расслаблению гладких мышц:

Ниже представлена общая схема (рис. 4.5) механизма ингибирующего действия ЛВ семейства виагры на фосфодиэстеразу-5:

L-Arg ------------à NO --------------à GCaza stimulation

NO-синтетаза

GTP ----------------à - PP + cGMP ---------------------à smooth muscle relax. ---à erection

! + PP! РDЕ-5 ß --------------viagra, levitra (49, 50)

GMP < -------------------------------!

Рис. 4.5. Схема механизма ингибирующего действия ЛВ виагры на РDЕ-5 - фосфодиэстеразу-5 (GCaza - гуанилатциклаза; GTP - гуанозинтрифосфат; cGMP - циклический гуанозинмонофосфат; GMP- гуанозинмонофосфат; PP - дифосфат).

В норме эректильная стимуляция имеет следующую последовательность. Аргинин под действием NO-синтетазы генерирует монооксид азота, который как вторичный мессенджер (сигнал) активизирует гуанилатциклазу. Активизация этого фермента приводит к ускорению циклизации гуанозинтрифосфата в циклогуанозинмонофосфат, который обладает сосудорасширяющим действием, расслабляя гладкие мышцы пористых (пещеристых) органов пениса. Этот эффект резко увеличивает ток крови к ним, что и вызывает эрекцию полового члена. При эректильной дисфункции (нарушении эрекции как следствие специфической импотенции) выделяется мало эндогенного монооксида азота, а фосфодиэстераза-5 быстро гидролизует cGMP, что приводит к сжатию гладких мышц, оттоку крови из пещеристых органов из пениса и его «падению». ЛВ (49, 50) ингибируют фосфодиэстеразу-5 и концентрация cGMP становится достаточно высокой для «возбуждения» пениса. Запатентована жевательная резинка с биологически активной добавкой виагры (от 5 до 100 мг его цитрата). Резинку рекомендуют жевать минимум две минуты, но за полчаса до полового акта. Полагают, что подобная доставка лекарства снизит вероятность побочных желудочно-кишечных расстройств. В настоящее время ведутся интенсивные работы по синтезу и поиску новейших лекарственных веществ, генерирующих NO в организме.

ЛЕКЦИЯ 12

4.3. Антитела и рецепторы. Их функции. Активные зоны

4.3.1. Антитела и их функции.

Еще одним специфическим классом эндогенных белков являются так называемые антитела, синтезируемые защитными системами организма. Самозащитная (иммунная) система человека включает В-лимфоциты, которые вырабатывают особые белки (иммуноглобулины или антитела), в функцию которых входит узнавание и обезвреживание ксенобиотиков (чужеродных веществ, антигенов), попавших в организм. Эти белковые структуры более комплементарны своим субстратам, чем ферменты. Задача антител заключается в том, что иммунная система, производящая их в огромном разнообразии использует их для защиты организма от инородных молекул – антигенов (гаптенов), путем прочного связывания последних (типа «захват пинцетом») и их удаления из организма в виде комплекса с антителом без какого-либо метаболического превращения. Разнообразие антител позволяет иммунной системе быстро подобрать такое антитело, которое наиболее соответствует (более комплементарно по структуре) чужеродному веществу. Поэтому активный центр антитела имеет обычно жесткую (в отличие от ферментов) структуру «замка», подбираемого к антигену-«ключу». Антитела состоят из четырех полипептидов: двух «тяжелых» цепей «А» (каждая по 400 АКО), связанных ковалентно между собой двумя дисульфидными мостиками, и двух легких цепей «Б» (по 200 АКО), несвязанных между собой, но связанных нековалентно с тяжелыми цепями (рис. 4.4). Концевые участки нековалентно связанной области четырех пептидных цепей различны у разных антител первичной структурой, что позволяет конформационно и химически узнавать и подстраиваться к любому антителу.

Рис.4.4. Схема четырехцепочечного иммуноглобулинового белка. А – тяжелые цепи; Б – легкие цепи (пунктирные линии означают слабые связи – водородные и др.

Главными из антител являются иммуноглобулины, пространственная структура которых составлена из β -складок и петель. На основе дизайна искусственных антигенов сейчас создаются биотехнологическим путем антитела для их использования в качестве ферментоподобных биокатализаторов, названных абзимами. Последние важны для синтеза лекарственных веществ, особенно в виде индивидуальных энантиомеров. Возможность дизайна безграничного разнообразия подобных абзимов позволит расширить круг их применения для биокатализа множества химических реакций (сейчас их более сотни), которые ранее ускорялись кислотами или основаниями, а также для биотехнологического производства различных ЛВ путем введения смоделированных абзимов непосредственно в клетку продуцента. Создаются антитела для связывания в организме больного токсических веществ, бактерий, патогенных вирусов и даже раковых клеток.

4.3.2. Рецепторные белки. Их функции. Активные зоны

В гл.7 – ДНК:.

Как правило, ферменты представляют собой белки, молекулярная масса которых достигает сотен тысяч и даже миллионов дальтон. Недавно найдено, что в некоторых микроорганизмах роль ферментов могут выполнять полирибонуклеотиды (т.е. РНК, названные рибозинами).

В гл.9 –пролонг:.

В последнее время было выделено несколько небольших природных пептидов (из кожи древесных лягушек, ганглий улиток, яда пауков), которые содержат одну или две D-аминокислоты. Было подтверждено, что D-форма аминокислотного остатка в такого рода пептидах резко увеличивает их устойчивость к гидролитическому действию экзо- и эндопротеаз. Этот факт все более учитывается в настоящее время при создании олигопептидных лекарственных веществ пролонгированного действия.

ЛЕКЦИЯ 12

4/2/5A Продолжение. Схема рационального дизайна ингибиторов ферментов при известной структуре фермента

Рациональный дизайн ПЛВ – ингибиторов ферментов по известной структуре мишени-фермента – самый точный, т.к. он основан на экспериментальных данных и на компьютерном моделировании. Он даёт ясное понимание о биоактивности ПЛВ и о том, как её улучшить по селективности и показателям фармакокинетики. В то же время этот подход требует значительных затрат труда, времени и финансовых ресурсов. В обобщённом виде процесс рационального дизайна ингибиторов ферментов изображён на рис.1 и заключается главным образом в нахождении высоко активного вещества и улучшении его свойств – эффективности и селективности биодействия, биодоступности (оральной), нетоксичности и достаточной дешевизне.

Мишень -----------------> Скрининг ------------------> Отбор ПЛВ из доступных источников; --------> Точная; первичный поиск фармакофора;

Её харак- расчёт ТМЗАС

теристики

1 2 3

Скрининг: --------------à Дизайн ПЛВ: ---------------------à Докинг: ------------------->

Экс. отбор комбинаторный; прогноз АРМЭТ

Хитов индивидуальный кинетика, КЗАС

4 5 6

Синтез: --------------> Эксперименты: -------------> Лидеры ---------------------->

Комби-й; биохим. и клет. по АРМЭТ

Индивид-й на мишени 9

7 (если нет, то к п.5)

Эксперименты на животных --------> клинич-е испытания ПЛВ на людях ---------à ингибитор (ЛВ)

10 11 12

Рис.1 Схема рационального дизайна ингибиторов ферментов по известной мишени и докингу.

4/2/5Б Продолжение. Докинг ПЛВ-ингибитора к ферменту известного строения

Как известно, докин г делят на слепой, когда пространственная структура АЦ не известна, и прямой с известным по данным РСА или ЯМР строением АЦ. В прямом докинге ориентация и связывание ингибитора с известным АЦ могут зависеть от наличие или отсутствия в АЦ фермента или в его непосредственной близости молекул воды, от природы молекул или ионов кофакторов и их координации с ЛВ, от таутомерных форм, конформаций и рК_а АКО и ЛВ, от рН микросреды в АЦ фермента, от конформационных изменений белка при его связывании с ЛВ.

4.2.5.1. Докинг в присутствии воды. При наличии в АЦ фермента молекул воды их либо учитывают при виртуальном докинге (если их присутствие в комплексе отражается на уровне биодействия) либо виртуально удаляют из АЦ. Ниже показан (рис. 6.1) докинг антигерпесного ЛВ ацикловира в АЦ тимидинкиназы HSV1 в присутствии двух молекул воды и кофактора аденозинтрифосфата (АТФ):

Glu 225 Tyr 101

Arg 222 Arg 176

ATP Gln 125

Glu 83

Tyr 132

Arg 163

Рис. 6.1. Докинг ингибитора ацикловира в АЦ тимидинкиназы TK HSV1 в присутствии двух молекул воды и АТФ.

Этот фермент фосфорилирует такие субстраты, как тимидин, пурины и их аналоги, включая и сам ацикловир:

цитозин тимин урацил аденин гуанин

По данным РСА полярный АЦ фермента состоит из двух частей – части с кофактором АТФ и части с, которая состоит из восьми АКО и двух молекул воды. Активная часть, содержащая хаотически распределённые молекулы воды, связывает природный субстрат, а при введении ЛВ связывается с ним и с двумя молекулами воды в комплекс. Координаты подобных комплексов и способы связывания многих тысяч потенциальных ингибиторов (скрининг на тимидинкиназе) изучены по программам и алгоритмам AutoDock и Flex X. Следуя алгоритму дизайна структуру основного лиганда (ацикловира и его аналогов) постепенно наращивали в активной зоне, начиная с их главных фрагментов. Этот приём позволял выявлять в конце протокола только одну активную конформацию ПЛВ с минимальной энергией (константы связывания K_i экспериментальные и прогнозируемые расчётом по формуле K_i = ∆ G/R^.T хорошо совпадали). В данном на рисунке 6.1 примере молекулы воды рассматриваются как хаотические части в отношении к лиганду ЛВ, имеющему заданные координаты в микросфере АЦ. Как видно, молекулы воды (также как и кофермент АТФ) не участвуют во взаимодействии ацикловира с ферментом (не образуют с ЛВ Н-связи). Для этого ингибитора и его пуриновых аналогов (ганцикловира и др.) лучшей оказалась геометрия, совпадающая с данными РСА для «пустого», обезвоженного АЦ. В то же время при моделировании эффективных ингибиторов было установлено, что в половине случаев скрининга тимидилзамещённых пиримидиновых лигандов АКО аргинина 176 АЦ фермента образует с фрагментом тимидина Н-связи АКО (через молекулы воды или без них). Производные пурина (29-33) являются противовирусными препаратами, созданными на основе концепции антиметаболитов нуклеиновых оснований:

Концепция антиметаболитов базируется на создании синтетического ЛВ, структурно близкого к какому-либо естественному (эндогенному) метаболиту организма человека. Задача такого ЛВ, называемого антиметаболитом (или псевдометаболитом), состоит в подмене метаболита в естественных биореакциях (прием «троянский конь»). Антиметаболиты должны быть способны лишь частично выполнять в организме функции метаболитов. Являясь химическими имитаторами эндогенных метаболитов, ЛВ такого рода " обманывают" контролирующие ферментные системы, встраиваются в метаболическую схему и заменяют собой настоящий метаболит, например, в растущей цепочке ДНК или РНК. Включение в НК псевдометаболитов с базовой структурой пиримидиновых и пуриновых оснований, указанных выше, приводит к прекращению роста, развития и репликации нуклеиновых кислот, что заканчивается гибелью организма. Важной характеристикой синтетических антиметаболитов, является то, что они обладают малой токсичностью и не оказывают нежелательных побочных эффектов, благодаря высокой степени их узнаваемости системами организма, для которых эти ЛВ структурно «выглядят» почти нечужеродными, биогенными.

Ацикловир (29) синтезировали в качестве аналога нуклеозида - дезоксигуанозина (34), участвующего в биосинтезе нуклеиновых кислот. Идея заключалась в том, чтобы ксенобиотик (29), попадая в зараженную вирусом клетку, имитировал собою эндогенный нуклеозид (34). Но поскольку в структуре этого ЛВ отсутствует рибозильный фрагмент с 5’-ОН- группой, при его введении в структуру растущей ДНК ее дальнейший рост должен прекратиться.

Так оно и оказалось, причем выяснилось, что ацикловир имеет самое мощное антивирусное действие в отношении вируса герпеса. Герпесные инфекции - очень распространенное явление. Достаточно сказать, что только в США ими заражены десятки миллионов человек. При герпесном энцефалите от воспаления мозга гибнут три четверти пациентов, а в случае химиотерапии ацикловиром выживаемость возрастает в три раза. Поэтому появление ацикловира в клинике быстро привело к его широкому использованию во всем мире. Ниже изображен механизм антивирусного действия ацикловира (обозначенного на схеме как HOCH₂CH₂OCH₂B) на молекулярном уровне. В зараженной клетке ацикловиру удается " обмануть" вирусный фермент тимидинкиназу и " подставить" себя вместо дезоксигуанозина для первого фосфорилирования по гликольному гидроксилу. Следующие два фосфатных остатка вводятся в монофосфат (39) уже киназами клетки-хозяина. Готовый трифосфат (40) ацикловира включается вирусной ДНК-полимеразой (вместо нормального дезоксигуанозинтрифосфата) в растущую реплицируемую цепь вирусной ДНК, в которой он уже служит стоппером, ибо после его включения в цепь рост новой ДНК прекращается и вирусная инфекция в зараженном организме подавляется. Вопрос, почему ацикловир не действует аналогичным образом на клетки хозяина остается пока открытым.

Моделирование показало, что отсутствие кетогруппы в пиримидиновом фрагменте не снижает антивирусное действие у дезоксигуанинового аналога ацикловира (29) - децикловира (44):

4.2.5.2. Докинг ингибиторов при наличии активного кофактора. Поиск ингибиторов фермента дегидрооротатдегидрогеназы (Enz_DOD), участвующей в биосинтезе пиримидиновых оснований через окисление оротовой кислоты в качестве эндогенного субстрата, перспективен для более успешного лечения раковых заболеваний, а также для поддержки ослабленного иммунитета, особенно в случае СПИДА. Этот фермент содержит два кофактора – флавинмононуклеотид (ФМН) и убихинон.

Флавиновая трехъядерная система (бензоптеридиновая) составляет основу витамина В₂ (рибофлавин, 12) и коферментов флавинмононуклеотида (ФМН, 13) и флавинадениндинуклеотида (ФАД, 14). Азадиеновая группировка во флавиновой системе (окисленная форма А) легко восстанавливается в форму (Б), а последняя может обратимо окисляться в форму (А). Эти флавины выполняют многообразные биологические функции: катализируют электронный перенос в редокс-реакциях аминов, спиртов и кислот; активируют молекулярный кислород и восстанавливают его в супероксид; переносят атомарный кислород на субстрат и включают его в молекулу воды. Они участвуют и в других реакциях метаболизма углеводов, липидов и белков. Основной функцией флавинов в дыхательной цепи является транспорт водорода. В окисленной форме трехъядерный гетероцикл флавина плоский. При захвате им двух атомов водорода (через образование свободного радикала в семихинонной форме) три цикла располагаются относительно друг друга в конформации «бабочка» (средний дигиропиразиновый цикл имеет конформацию «ванна»).

Убихинон (кофермент Q, КоQ, 1) относится к производным пара-бензохинона с длинной полиизопреноидной цепью с Е-конфигурацией и числом мономерных единиц “n’ от 6 до 10. Он участвует в дыхательной цепи в качестве переносчика электронов, восстанавливаясь в присутствии протонов до формы КоQ-Н₂ (2):

(1) окисленная форма KoQ (n=6-10) (2) восстановленная форма KoQ

При передаче электронов эта смесь 1, 4-бензохинонов претерпевает превращения через ион-радикальны (А, Г) и нейтральные радикалы (семихиноны Б, В):

(1) (А) (Б) (В)

(Г) (2)

Окисление восстановленной формы коферментов Q (2, стадия 4) и все последующие реакции (5-8) протекают при участии цитохромов - белков, содержащих геминовое железо. При недостатке убихинона в организме начинает быстро развиваться сухость и дряблость кожи. Установлено, что он, являясь эффективным антиоксидантом, тормозит старение не только кожи. Выделяют убихинон-10 из морских водорослей.

Дизайн ПЛВ показал, что в качестве лидерных ингибиторов дегидрооротатдегидрогеназы (Enz_DOD) могут выступать соединения (3-6):

Ингибиторы фермента дегидрооротатдегидрогеназы (Enz_DOD) (3-6):

- C(O)-NH-C₆H₄(CF₃-4) (3) лефлуномид (пролекарство)

Me-C=C-C(O)-NH-C₆H₄(CF₃-4) (4)истинныйингибитор
HO CN

2-R-C6H4-C C-C (5) R = F, бреквинар; (6) R = H, монодефторбреквинар

ЛВ (3-6) являются неконкурентными ингибиторами как дегидрооротата, так и убихинона (1), который располагается в гидрофобном «туннеле» АЦ дегидрооротатдегидрогеназы (рис. 6.2). Ингибитор (4) связывается в этом «туннеле» с убихиноном и блокирует перенос электронов при окислительном фосфорилировании. Флавин ФМН (13), располагающийся в «кармане» АЦ рядом с дегидрооротатом, нормально восстанавливается им, а затем передаёт протон на убихинон (1). В связи с этими данными при прогнозировании докинга ингибирования сохраняют дегидрооротат-субстрат и ФМН в АЦ фермента, а моделируют докинг только с убихиноном (1), связанным в «туннельной» апоферментной части белка. При дизайне показано, что неактивная форма проЛВ (3) локализуется не в «туннеле, а на входе в него, но рядом из-за низкой аффиности. В то же время истинный ингибитор (4) проходит в глубь этого туннеля благодаря сильному кооперативному взаимодействию с рядом АКО (например, с Arg 136 и Gln 47) и самим убихиноном, что позволяет блокировать функции последнего.

Asn 145 Arg 136

Gln 47

Рис. 6.2.Прогнозируемый докинг ингибиторов (3-6).

Таким образом, коферменты в активной зоне фермента могут участвовать в в докинге ЛВ, а необходимость моделирования их влияния на докинг очевидна для увеличения точности предсказаний биактивности ПЛВ.

4. 2.5.3. Учёт таутомерии в дизайне докинга фермент-ингибирующих ПЛВ

Прототропный сдвиг в ПЛВ приводит к новому типу вещества или к молекуле с новым набором функциональных групп. Это означает глубокое изменение сродства ПЛВ к биомишени и даже появление нового типа биоактивности. Так, тачигарен (2) обладает свойствами как регулятора роста растений (стимулирует корнеобразование, повышает урожайность и сахаристость сахарной свеклы, ее устойчивость к низким температурам), так и фунгицида (для борьбы с почвенными патогенами (гнилями сахарной свеклы, риса и овощных культур). Установлено, что причиной двойственного биодействия тачигарена является образование из него в растениях двух таутомерных метаболитов (3 и 4), из которых N-b-глюкозид (4) является истинным активатором ферментных систем растения - рострегулятором, а О-b-глюкозид (3) является истинным ингибитором ферментной системы патогенного гриба, вызывающего гниение этого же растения, т. е. фунгицидом. Производное изоксазола (2) получают реакцией 1, 3-циклоприсоединения гидроксиламина к эфирам бутин-2-овой кислоты (1):

На важность таутомерных событий указывают природные мутации в ДНК, происходящие в результате нарушений комплементарности азотистых оснований из-за их таутомерных превращений. Очевидно, что подобные таутомерные превращения надо учитывать в совокупности с изменениями рН микросреды, основности и кислотности АКО (рК_а), типа и природы Н-связей, а также конформаций ПЛВ и АЦ в прогнозировании биодействия ПЛВ и других биологически активных веществ (БАВ), их распознавании и докинге к АЦ ферментов.

Ниже приводится пример прогноза докинга, подтверждённого данными РСА, иминольной таутомерной формы барбитурата, которая ингибирует металлопротеазы (рис. 6.3). Эта форма (А) превалирует в гидрофобном АЦ белковой матрицы. Но в водном растворе превалирует не активный диамидный таутомер (Б).

Glu 198

Ala 161

Ala 160

(А) в воде (Б) в АЦ белка

Рис.6.3. Экспериментальный (РСА) и прогнозируемый (наложением) докинг барбитуратного ингибитора цинкопротеазы.

По полученным данным неорганический кофактор ион цинка координирует с сдвумя лигандами – карбоксильным кислородом АКО 198 и кислородом гидроксильной группы при С-2 иминольного таутомера (А). Сам таутомер (А) связан с АЦ двумя донорными (АКО 161 и 198) и двумя акцепторными (вилочного типа с АКО 160) Н-связями. Белки подобного типа контролируют транскрипцию генов. Эти белки имеют характерные мотивы, состоящие из α -спирали и двухтяжевого антипараллельного β -листа, которые связаны с ионом цинка. Такими структурными «цинковыми пальцами» белок селективно охватывает участок ДНК, предназначенный для транскрипции (рис. 6.4). Таким образом, прогноз по выбору активного таутомера-ингибитора может влиять на биосинтез ДНК при разработке ЛВ.

Рис. 6.4. Комплекс участка ДНК с цинкопротеазой

4.2.5.4. Стереохимическая комплементарность ингибитора. Необычное исследование было проведено по дизайну ингибиторов протеазы ВИЧ среди производных каркасных соединений класса функционально замещённых производных фуллерена С₆₀. Дело в том, что по данным РСА этот фермент формирует АЦ в виде цилиндрического туннеля с выстилкой главным образом из гидрофобных АКО и нескольких остатков аспарагиновой кислоты. Диаметр этой активной полости соответствовал диаметру сферической молекулы С₆₀. При компьютерном дизайне молекулярного докинга диаминопроизводного этого фуллерена установили, что, во-первых, данное ПЛВ достаточно свободно входит внутрь туннеля АЦ, где связывается с его внутренней поверхностью силами гидрофобного взаимодействия, а во-вторых, аминогруппы фуллерена прочно закрепляют этот потенциальный ингибитор внутри АЦ за счёт ион-ионной связи с карбоксильными группами двух остатков аспарагиновой кислоты (рис. 6.5). Таким образом происходит стереохимическое блокирование туннельного АЦ для физического доступа эндогенного субстрата.

___________________________________________________________1

1___________________________________________________________

Рис. 6.5. Дизайн ингибирования протеазы ВИЧ диаминофуллереном С₆₀.

В 1950-1960-х годах был синтезирована группа очень важных пиридинальдоксимов, например, (1-3), используемых в качестве антидотов (противоядий) при отравлении фосфорорганическими пестицидам:

По механизму биодействия они оказались реактиваторами фермента холинэстеразы. Нормальная функция этого фермента, заключающаяся в гидролизе нейромедиатора ацетилхолина (4) на неактивный холин и уксусную кислоту, блокируется такими пестицидами как паратион или О, О-диэтил-О-паранитрофенилтиофосфат (5), а также боевыми отравляющими веществами нервнопаралитического действия типа зарина (изопропиловый эфир метилфторфосфоновой кислоты, 6).

Эти яды имеют большее сродство к остаткам серина (его гидроксилу) и аспарагиновой кислоты (ее свободной карбоксильной группе), находящимся в активном центре холинэстеразы. Ингибированный таким образом фермент перестает перерабатывать нейромедиатор, что приводит к перевозбуждению холинорецепторов и нервной системы из-за резкого повышения концентраций ацетилхолина. Антидоты (1-3, 7) действуют по принципу фармакологического антагонизма: они деблокируют фермент холинэстеразу за счет их более прочного взаимодействия с фосфорорганическим ядом (рис. 6).

Рис. 6. Схема двухточечного взаимодействия холинэстеразы с нейромедиатором ацетилхолином (приведены также его изостеричные антагонисты - паратион, зарин и деблокатор-антидот аллоксим, 7).

Производные 1, 4-дигидропиридина с антигипертензивным действием. Эти представители блокаторов кальциевых каналов составляют большой фармацевтический блок вазодилататоров и антигипертензивных средств (несколько десятков препаратов этого типа, например, никардипин, нифедипин, фелодипин и др.):

Нифедипин – один из наиболее популярных ЛВ первого поколения (с 1975г.). Он входит в состав почти ста препаратов, в том числе и пролонгированных форм. Никардипин, фелодипин, флуордипин и амлодипин принадлежат к препаратам второго поколения, а лерканидипин – к третьему поколению. Большинство их них получают по методу Ганча конденсацией ароматических альдегидов с ацетоуксусным эфиром (и его производными) в присутствии ацетата аммония, или из арилиденацетоацетатов и 3-аминокротонатов:

В хиральных дигидропиридинах R- и S-энантиомеры могут обладать различным биодействием. Фармацевтические исследования показали, что в некоторых случаях второй стереоизомер мог даже повышать кровяное давление (т.е. оказывать обратный эффект – деблокировать кальциевые каналы, быть агонистом кальция). В связи с этим стоит важная современная задача по разделению энантиомеров несимметричных дигиропиридинов и использованию чистых энантиомеров в лечении.

Механизм биодействия дигидропиридинов основан на перекрывании каналов клеточной мембраны, через которые из окружающей клетку среды (где концентрация ионов кальция составляет 3.10^-3 М) внутрь клетки (концентрация Ca⁺² = 1.10^-7 М) поступают ионы кальция, вызывающие различные биореакции и в том числе сокращение гладких мышц сосудов (рис.7).

Рис. 7. Схема биотранспорта ионов кальция внутрь клетки и из неё. Указано место блокирования доступа Са (II) внутрь клетки при взаимодействии лекарственного вещества (ЛВ) с ДПГ-рецептором (пояснения в тексте). ИК - ионофорный канал (см. рис. 8).

Нормальный обратный отток отработавших ионов кальция против градиента концентраций обеспечивается ферментом кальций-АТФазой - кальциевым насосом, использующим энергию (Е) АТФ, получаемую по реакции:

Enz + АТФ ® Enz-Ф + АДФ + Е

При нарушениях их обратного транспорта из клетки или при слишком интенсивном их поступлении внутрь ее, возникает гипертония, увеличивается нагрузка на сердечную мышцу, что может привести к инфаркту миокарда. Дигидропиридины (ДГП) взаимодействуют со своими рецепторами (ДГП-рецепторы), которые, по-видимому, расположены в непосредственной близости к кальциевым каналам и блокируют последние. 1, 4-ДГП блокирует эти каналы также за счет увеличения выхода NO из эндотермия гладких мышц. Это приводит к резкому уменьшению поступления ионов кальция в клетку и, таким образом, к расслаблению мышцы кровяного сосуда, снижению давления и облегчению работы сердца при ишемической болезни и инфарктах.

Обнаружено, что поли- b-гидроксимасляная кислота присутствует в виде природного стереорегуляторного полиэфира (полиБОМК) в плазме крови человека. Оказалось, что этот полиэфир входит также в состав мембранных каналов, служащих для биотранспорта ионов кальция через клеточные мембраны (рис. 8).

Рис. 8. Схема ионофорного канала для транспорта ионов кальция через клеточную мембрану (полиБОМК - поли-b-оксимасляная кислота).

ПолиБОМК совместно с полифосфатом образует двуспиральный комплекс, пронизывающий липидную мембрану. Спираль неорганического полифосфата расположена внутри спирали органического полиэфира. Причем липофильные метильные группы последнего ориентированы наружу, а полярные С=О и С-О-С группы - внутрь. Ионы кальция связаны с полифосфатом и координационно свзаны со сложноэфирными группами органического полимера. При ферментативном гидролизе полифосфата ионы кальция могут поступать во внутриклеточную цитоплазму, где в качестве вторичного сигнала вызывают соответствующие биохимические реакции. Установление строения ионофорного канала позволяет приступить к дизайну новой группы ЛВ.

ЛЕКЦИЯ 13

4.3. Антитела и рецепторы. Их функции. Активные зоны

4.3.1. Антитела и их функции.

Еще одним специфическим классом эндогенных белков являются так называемые антитела, синтезируемые защитными системами организма. Самозащитная (иммунная) система человека включает В-лимфоциты, которые вырабатывают особые белки (иммуноглобулины или антитела), в функцию которых входит узнавание и обезвреживание ксенобиотиков (чужеродных веществ, антигенов), попавших в организм. Эти белковые структуры более комплементарны своим субстратам, чем ферменты. Задача антител заключается в том, что иммунная система, производящая их в огромном разнообразии использует их для защиты организма от инородных молекул – антигенов (гаптенов), путем прочного связывания последних (типа «захват пинцетом») и их удаления из организма в виде комплекса с антителом без какого-либо метаболического превращения. Разнообразие антител позволяет иммунной системе быстро подобрать такое антитело, которое наиболее соответствует (более комплементарно по структуре) чужеродному веществу. Поэтому активный центр антитела имеет обычно жесткую (в отличие от ферментов) структуру «замка», подбираемого к антигену-«ключу». Антитела состоят из четырех полипептидов: двух «тяжелых» цепей «А» (каждая по 400 АКО), связанных ковалентно между собой двумя дисульфидными мостиками, и двух легких цепей «Б» (по 200 АКО), несвязанных между собой, но связанных нековалентно с тяжелыми цепями (рис. 4.4). Концевые участки нековалентно связанной области четырех пептидных цепей различны у разных антител первичной структурой, что позволяет конформационно и химически узнавать и подстраиваться к любому антителу.

Рис.4.4. Схема четырехцепочечного иммуноглобулинового белка. А – тяжелые цепи; Б – легкие цепи (пунктирные линии означают слабые связи – водородные и др.

Главными из антител являются иммуноглобулины, пространственная структура которых составлена из β -складок и петель. На основе дизайна искусственных антигенов сейчас создаются биотехнологическим путем антитела для их использования в качестве ферментоподобных биокатализаторов, названных абзимами. Последние важны для синтеза лекарственных веществ, особенно в виде индивидуальных энантиомеров. Возможность дизайна безграничного разнообразия подобных абзимов позволит расширить круг их применения для биокатализа множества химических реакций (сейчас их более сотни), которые ранее ускорялись кислотами или основаниями, а также для биотехнологического производства различных ЛВ путем введения смоделированных абзимов непосредственно в клетку продуцента. Создаются антитела для связывания в организме больного токсических веществ, бактерий, патогенных вирусов и даже раковых клеток.

-

4.3.2. Рецепторные белки как биомишени

4.3.2.1. Строение и функции

Рецепторами называют биологически важные белки, интегрированные в клеточную мембрану, которые способны «узнавать» и невалентно селективно связывать специфические эндогенные или чужеродные агенты в виде комплекса, изменяя при этом свою конформацию и передавая тем самым сигнал внутрь клетки для запуска в ней соответствующего каскада биохимических реакций. Подобное событие генерирует физиологический ответ организма на появление в нём указанного агента. При этом рецептор в отличие от фермента не катализирует какое-либо химическое превращение агента-лиганда. Белки, выполняющие рецепторные функции (далее рецепторный белок будем обозначать сочетанием двух букв РБ), составляют более 20% от всех биомишеней. Они присутствуют в клеточном материале в очень небольших количествах и в сободном виде (их можно выделить обработкой клеток детергентами) часто мало устойчивы. В связи с этим на настоящее время функции РБ изучены намного лучше, чем их строение. РБ не обязательно представляют собой единичный белок. Они могут быть составлены из двух-трех белков, связанных друг с другом в виде комплексов, или даже мозаики из многих белков (субъединиц). РБ имеют три части – внеклеточную часть, мембрано-пронизывающую и внутриклеточную часть. Внешняя часть (в которой имеется активная зона, состоящая из 20-25 аминокислотных остатков) предназначена для взаимодействия с лигандом (ЛВ). Образующийся из РБ и ЛВ ансамбль благодаря возникшим конформационным изменениям в РБ-части передает, как уже говорилось выше, внешний сигнал (поступающий от лиганда) через мембрану внутрь клетки. Конформационный сигнал далее передаётся по внутриклеточной части РБ на G-белок, связанный с ней виде комплекса, что активирует G-белок. В свою очередь G-белок, получив сигнал, инициирует каскад внутриклеточных биореакций по синтезу различных веществ, необходимых клетке в соответствии с природой возникшего сигнала. Внутриклеточные G-белки совместно со связанными с ними рецепторными белками занимают 1% всего генома организма позвоночных. Поэтому расширение знания структуры и функций белков, входящих в этот пул раскрывает богатейшие возможности для создания новейших лечебных препаратов.

Рассмотрим конкретный пример подобного взаимодействия РБ с агентом-лигандом. Как известно, клетки нервной системы (нейроны), не имеют непосредственного контакта друг с другом. Они разделены синаптическими щелями, через которые сигнал (передаваемый в виде бегущей по нейронной мембране волны поляризации-деполяризации) пройти не может без определенного посредника, называемого нейромедиатором (или нейротрансмиттером). Передача нервного импульса от одного нейрона к другому происходит следующим образом (см. рис.1, схема А).

Рис.1. (А). Передача нервного импульса ацетилхолином(АХ) и его синтетическими холиномиметиками (САХ) через синаптическую щель. (Б). Расширение ионофорного канала в рецепторе (R) под действием АХ.

По достижении нервным сигналом конца возбужденной клетки (нейрон 1) в её пресинаптической области синтезируется нейротрансмиттер (АХ), который затем выбрасывается в синаптическую щель и быстро диффундирует к своему рецептору (R), расположенному в постсинаптической мембране покоящейся клетки (нейроне 2). Один из рецепторов ацетилхолина представляет собой белок, состоящий из пяти субъединиц (рис.1, схема Б). Этот интегральный, пронизывающий защитную мембрану, белок образует цилиндрический канал, который с одной стороны выступает на 65 Å в синаптическую щель, а с другой - пронизывает липидный бислой мембраны, входя на 15 Å внутрь клетки. Этот узкий канал (или пора) расширяется до 20 Å при " посадке" на рецептор нейромедиатора (комплекс R^.АХ) за счет резкого уменьшения вращательного (конформационного) движения субъединиц. Увеличение размера канала облегчает прохождение ионов K⁺ и Na⁺ через мембрану против электрохимического градиента. При этом изменяется мембранный потенциал покоящегося нейрона (2), и в нем генерируется нервный импульс, после чего нейромедиатор гидролизуется ацетилхолинэстеразой до неактивного холина и инофорный канал закрывается.

РБ и взаимодействующий с ним агент-лиганд (в нашем контексте это ПЛВ или ЛВ) обладают на молекулярном уровне информацией, которую они считывают при приближении друг к другу, и тем самым распознают друг друга. В процессе распознавания включается энергия их координационного взаимодействия (по точкам и в целом) и формируется их комплекс. Подобное распознавание и взаимодействие основано на принципе двухсторонней комплементарности РБ и ПЛВ с точки зрения их геометрического и энергетического соответствия. Рецептор, как и фермент, имеет активную зону с закодированной информацией о себе – о размере, форме, структурном графе (вер