Методи виділення і аналізу білків

1.1.1. Висолювання (осадження) білків. Випадання білків в осад, під час дії розчинів нейтральних солей амонію, лужних і лужноземельних металів називається висолюванням. Солі лужних і лужноземельних металів викликають зворотне осадження білків, тобто після їх видалення білки знову набувають здатності розчинятися, зберігаючи при цьому свої нативні властивості.

Під час висолювання відбувається дегідратація макромолекул білка, і нейтралізація заряду білкових частинок, за допомогою іонів солей, які адсорбуються на них. У зв’язку з цим, білкові розчини втрачають свою стійкість, частинки білка злипаються і випадають в осад.

На процес висолювання впливає ряд факторів:

1. Гідрофільність білка.

2. Відносна молекулярна маса білка.

3. Заряд білка.

4. Природа і концентрація солі.

5. рН середовища та температура.

Таким чином, розчинність білків сильно залежить від концентрації солей (від іонної сили). В дистильованій воді білки зазвичай розчиняються погано, однак їх розчинність зростає у міру збільшення іонної сили. Зі збільшенням іонної сили молекули білків позбавляються гідратних оболонок, що, як було вказано вище, і призводить до випадання їх в осад. У зв’язку з цим, для висолювання різних білків необхідна різна концентрація одних і тих же солей. Наприклад, різні білки висолюються з розчинів при різних концентраціях нейтральних розчинів сульфату амонія - (NH₄)₂SO₄, так - альбуміни осаджуються насиченим, 100 % розчином сульфату амонія, оскільки у них відносна маса більша ні ж у глобулінів, а глобуліни осаджуються напівнасиченим, 50 % розчином сульфату амонію. Також, чим більш розчинність білка, тим більша концентрація солі необхідна для його висолювання.

1.1.2. Діаліз. Діалізом називається процес розділення високомолекулярних і низь молекулярних речовин за допомогою напівпроникних мембран. При цьому низькомолекулярні речовини заміщуються буфером.

Діаліз широко використовується для очищення білків від наявності низькомолекулярних сполук (солей, цукрів та ін..), які легко проходять через пори напівпроникних мембран. Наприклад, для видалення сульфату амонію із препарату протеїну. Білкові молекули, мають великі молекулярні маси, тому не можуть проникати через штучні, або природні мембрани (колоїд, пергамент, целофан, та ін.). Пристрій, в якому проводиться діаліз називається діалізатором. Найпростіший діалізатор являє собою мішечок із напівпроникного матеріалу, в який заливається діалізуюча речовина(рис.1.).

Рис. 1. Схема діалізатора, та спрощена схема дифузії речовин через напівпроникну мембрану.

Мішечок опускається в стакан з буфером. Білок залишається в мішечку, а низькомолекулярні речовини шляхом дифузії проходять через мембрану і зовнішній розчин.

Традиційним є спосіб діалізу через целофановий мішечок. Для повного видалення низькомолекулярних речовин в процесі діалізу необхідна постійна зміна буферного розчину в діалізаті. Після багаторазової заміни зовнішнього буферного розчину, склад середовища в діалізному мішечку (концентрація солей, рН та ін..) буде таким же, що й у зовнішньому розчині.

1.1.3. Метод Лоурі. Метод Лоурі - один з колориметричних методів кількісного визначення білка в розчині. Запропонований Лоурі (Lowry) в 1951 році. Принцип методу полягає в тому, що в лужному середовищі, іони Cu⁺² утворюють комплекс з пептидними зв’язками, і переходять в Cu⁺ . Одновалентні іони міді, а також радикальні групи тирозину, триптофану, та цистеїну, реагують з реактивом Фоліна (фосфомолібденова кислота з фенолом), утворюють нестабільний продукт, який переходить в молібденову синь, під дією тирозина, і триптофана, з максимумом поглинання при 750 нм. Збільшення поглинання при 750 нм пропорційно концентрації білка. Чутливість до білка становить 10 - 100 мкг/мл. Метод є дуже чутливим щодо наявності в розчині інших речовин, які в свою чергу можуть мішати при визначення білка з реактивом Фоліна. До таких речовин можна віднести гуанін, ксантин, феноли (за виключенням нітрофенолу), амінокислоти тирозин, гліцин, гістидин, також вплив має сульфат амонія, гідразин. Визначенню білка за допомогою метода Лоурі також перешкоджають тіолові сполуки, вуглеводи, гліцерин, детергенти, інои калію, дисульфідні реагенти, антибіотики, та інші фізіологічно-активні речовини. Наявність в білкових препаратах продуктів перекисного окислення ліпідів також може призвести до незначних помилок. Також, деякі речовини, які використовуються для приготування буферних розчинів, окрім утворення неспецифічної зафарбованої сполуки, знижує взаємодію реактива Фоліна з білками. Таким чином, при використанні метода Лоурі, велика кількість різних сполук може спотворити картину справжнього вмісту білка і його фракцій. Ще одним недоліком даного методу є те, що використовуються два реактиви, які мають невеликий термін зберігання.

1.1.4. Метод спектрофотометрії. Пристрій для визначення спектральних залежностей коефіцієнта пропускання, або оптичної густини називається спектрофотометром. Найчастіше. Спектрофотометри мають діапазон вимірів по довжинам хвиль від 180 - до 1100 нм. Цей діапазон включає в себе три області спектра: ультрафіолетову (УФ) - 180-380 нм; видиму - 380-760 нм та інфрачервону (ІЧ) - 760-1100 нм. Спектри поглинання світла речовиною, визначаються різницею енергій між енергетичними рівнями при переході електронів з нижнього рівня на вищий, та можливістю переходів між рівнями.

Визначення концентрації білка методом спектрофотометрії побудований на здатності ароматичних амінокислот, а саме - триптофана, тирозина, і меншою мірою фенілаланіна, поглинати ультрафіолетове випромінювання при довжині хвилі у 280 нм. Спектральні властивості триптофана визначаються його індольним кільцем. Триптофан має дві області поглинання - в області 218 та 280 нм. Молярний коефіцієнт поглинання цієї амінокислоти в 4 рази більший ніж тирозина, та в 30 разів більший ніж у фенілаланіна. Спектр поглинання тирозина обумовлений його фенольним кільцем. Максимум знаходиться при 222 та 275 нм. Спектральні властивості фенілаланіна визначаються його бензольним ядром. Спектр характеризується максимумом при 275 нм. Більшість білків має максимум поглинання при довжині хвилі у 280 нм. Вимірюючи величину оптичної густини за довжини хвилі 280 нм визначають кількість білка в розчині. Однак, білки відрізняються між собою за складом ароматичних амінокислот, тому їх поглинання в ультрафіолетовій області спектра може сильно відрізнятися. Окрім того, невелике помутніння розчину може призвести до помилок під час вимірювань.

1.1.5. Гель-фільтрація. Для розділення білків часто використовують хроматографічні методи, які базуються на розподілі речовин між двома фазами, одна з яких є рухомою, інша ж нерухома. В основу хроматографічних методів закладені різні принципи: гель-фільтрації, йонного обміну, адсорбції, та ін..

Метод розділеня білків за допомогою гель-фільтраційної хроматографії базується на тому, що речовини, які відрізняються за молекулярною масою, по-різному розділяються між рухомою та нерухомою фазами. Таким чином, за допомогою цього методу можна швидко розділити білки у відповідності з їхніми розмірами та формою молекул.

Носієм для хроматографії є гель, що складається з поперечно-зшитої тривимірної молекулярної сітки сформованої у вигляді гранул. Найчастіше використовують сефадекси. Сефадекси (se paration pha rmacia dex tran) - це продукти взаємодії полісахарида декстрана з епіхлоргідрином (рис.2.).

Рис.2. Структура сефадекса

Сефадекси є стійкими до дії органічних розчинників, розчинів лугів, і розбавлених кислот, а також нерозчинні у воді. Завдяки великому вмісту гідроксильних груп, гранули сефадекса легко набухають у водному середовищі, або ж у буферному розчині, з утворенням гелю, яким і заповнюють хроматографічну колонку. Чим вища здатність геля до набухання, тим вищий номер сефадекса. Робочий діапазон рН складає 2-10. Існує декілька типів сефадексів, які різняться між собою за розмірами, кількістю та величиною гранул. При розділенні суміші білків використовують сефадекси тонкого або супертонкого зерніння (G-100, G-250). Чим менші частини гелю, тим ефективніше проходить розділення

Нерухома фаза - це рідина всередині гранул сефадекса, в яку можуть проникати низькомолекулярні речовини і білки з невеликою молекулярною масою. Суміш білків, що наносять на хроматографічну колонку, вимивають, пропускаючи через колонку розчинник. Разом з фронтом розчинника рухаються і молекули білків, з великою молекулярною масою і розмірами, які не дифундують всередину зерен сефадекса. Таким чином - вони першими вимиваються із колонки. Більш дрібні молекули дифундують всередину гранул сефадекса і на деякий час попадають в нерухому фазу, в результаті чого їх рух сповільнюється (рис.3.). Величина пор визначає розмір молекул, які можуть проникати всередину гранул.

Рис. 3. Схема гель-хроматографії на колонці з сефадексом.

(Великі кружечка з хрестиком - зерна сефадекса, малі чорні і червоні кружечка та трикутники - білки з різною молекулярною масою)

А- колонка на початку роботи

Б, В, Г - колонка в різні періоди роботи. (розділення білкових компонентів в залежності від молекулярної маси та величини молекул).

1.1.6. Електрофоретичне розділення білків. Метод електрофорезу базується на відмінностях в швидкості руху білків в електричному полі, яка визначається величиною заряду білка при певних значеннях рН і іонної сили розчину. Так, швидкість руху білків в електричному полі пропорційна їх сумарному заряду. Білки, які мають сумарний заряд негативний рухаються до анода (+), а позитивно заряджені білки рухаються до катода (-). За допомогою методу електрофореза можна не тільки розділити протеїни, а й візуалізувати їх, що дає змогу швидко визначити кількість різних протеїнів у суміші чи ступінь чистоти зразка індивідуального протеїну. Електрофорез також допомагає визначити деякі важливі властивості протеїнів, а саме: їхню ізоелектричну точку і приблизну молекулярну масу.

Електрофорез проводять на різних носіях, включаючи - на папері. Останнім часом широкого поширення набули методи зонального електрофорезу білків на твердих розчинах: гелях крохмалю, поліакриламіду, агарози та ін. Їхні переваги в тому, що виключається можливість розмивання границі білкок-розчинник в результаті дифузії, та для аналізу необхідна невелика кількість білка. Поліакриламідний гель функціонує як молекулярне сито. Також на відміну від електрофорезу на папері, де швидкість руху білків пропорційна тільки їх сумарному заряду, в поліакриламідному гелі швидкість руху білків пропорційна їх молекулярній масі, оскільки використовується детергент додецилсульфат натрію (ДС-Na, SDS, sodium dodecyl sulfate). Додецилсульфат натрію зв’язується з більшістю протеїнів у кількості, приблизно пропорційній до молекулярної маси протеїну, тобто близько однієї молекули ДС-Na на кожні два амінокислотні залишки. Зв’язаний ДС-Na надає утвореному агрегату великого негативного заряду, який значно перевищує власний заряд молекули протеїну, тому кожен протеїн має подібне співвідношення заряду до маси. Внаслідок зв’язування ДС-Na змінюється нативна конформація потеїнів. Таким чином, електрофорез за наявності ДС-Na розділяє протеїни майже винятково за їхньою молекулярною масою: чим вона менша тим швидше рухається поліпептид у гелі. В результаті цього можна отримати більше різноманітних фракцій білка. Якщо білки попередньо не денатурувати швидкість їх міграції в гелі буде залежати не тільки від молекулярної маси, а й від величини молекул, форми молекул та сумарного заряду.

Для візуалізації білкових фракцій гель обробляють барвником, молекули якого зв’язуються з білковою глобулою, але не з гелем. Зазвичай, використовують кумасі яскраво-синій. Після цього гель відмивають від барвника, що залишився незв’язаним, і пофарбовані полоси білка стають добре помітними неозброєним оком. Молекулярну масу досліджуваного білка можна легко визначити, якщо порівняти його розташування в гелі з розташуванням протеїнів відомої молекулярної маси (маркерів).