Результати дослідження та їх обговорення

3.1. Виділення білків та їхня очистка. При підготовці до прведення усіх дослідів було визначено необхідні розчини та реактиви. Як результат більшість розчинів було приготовано заздалегідь, а саме - реактив А, В, та С. Окрім того було приготовано сток 0.2 М К-фосфатного буферу (рН = 7.0), який використовували для діалізу, зберігання білка, проведення гель-хроматографії. Стоковий розчин К-фосфатного буферу перед використання розводили до концентрації у 0.05 М.

В першу чергу, дл я проведення експерименту, було виділено 20 мл білку перепелиних яєць. Отриманий об’єм розділили на 2 частини. Кожну з яких висолювали, однак у першому випадку висолювання проводили у дистиляті з додаванням сульфат амонію. У другому ж випадку використовували К-фосфатний буфер та сульфат амонію. Після осадження центрифугуванням білків, для того щоб визначити концентрацію отриманих розчинів проводили діаліз, щоб позбутися амоній сульфату. Діаліз здійснювався у 0.05М К-фосфатному буфері. Діаліз проводили протягом 8 днів (з 03.05.12 по 11.05.12). Кожного разу проводили перевірку на наявність сульфату амонія, за допомогою Ba(OH)_2.

3.2. Визначення концентрації білка. Визначення концентрації зразку перед хроматографією є необхідним для того, щоб визначити яку ж кількість досліджуваного зразка наносити на колонку. Для того щоб встановити яка ж була концентрація досліджуваного нами білку було побудовано калібрувальний графік, за БСА, з початковою концентрацією 1мг/мл. Однак під час проведення методу Лоурі було спочатку отримано замість синього забарвлення розчинів білків - рожевий. Це можна пояснити або тим, що в процесі діалізу досліджуваний білок гідролізував повністю, та пептони що утворились могли дати рожеве забарвлення з реактивом Фоліна, або ж тим, що неправильно було приготовано реактиви А та В. Тому було проведено повторне фарбування, з новими реактивами, та як результат, на цей раз забарвлення було синім. Яким і повинно було б бути.

Послідовне розведення білку робили за двома схемами розведення: 1) концентрації 300, 150, 75, 37, 5, 18, 75; 2) концентрації 250, 125, 62, 5, 31, 25, 15, 625. Та побудували 2 калібрувальних графіка з яких вибрали другий варіант для подальшого використання.

3.3. Розділення суміші білків за допомогою гель-фільтрації. Спочатку, для проведення гель-фільтрації, використовували уже підготовлену іншою групою колонку. Однак, оскільки хроматографія не вдалась, через неправильне визначення концентрації білку та завеликий об’єм зразку що нанесли на колонку, хроматографічну колонку перепаковували, а сефадекс промивали К-фосфатним буфером, для того щоб очистити від білку. Як і під час проведення першої хроматографії, використовували той же самий сефадекс. А саме G - 100 (розмір гранул: 40-120 мкм). Очікуваним було отримання 4 ракцій білку, однак в результаті проведення хроматографії, чітко можна виокремити тільки 1 пік, що знаходився в зоні 8-19 проб, також можна було взято для дослідження зразки й з інших. Зовсім малих піків, що знаходилися в межах 24-27 і 54-56 проб. Оскільки в результаті не було отриманго очікуваних результатів, це можна пояснити тим. Що сефадекс, який використовувався, має розмір гранул більший за розмір альбумінів і глобулінів, які можливо затримались у гранулах сефадексу і вийшли всі однією фракцією.

3.4. Електрофорез. Електрофорез, як і хроматографію, не вдалося провести з першого разу нормально. Під час першого проведення електрофорезу після нанесення зразків не було нанесено еклетродного буфера поверх них, окрім того концентрую чого гелю була занадто велика кількість. Другий електрофорез провели уже без допущення таких помилок. Послідовність, в якій було нанесено зразки, а також концентрація солі, яку використовували для висолювання досліджуваного зразку, та розведення, яке робили для того, щоб досягти стандартної концентрації білку необхідної для електрофорезу в 1 мг/мл, наведено нижче.

Таблиця 3.4.1.

Послідовність нанесених зразків в електрофорезі

Після проведення форезу, можна було чітко спостерігати поділ зразків на 3 фракції. Неможна й не зауважити, що всі доріжки зі зразками були “забруднені”, тобто можна зробити висновок, що окремі білки, під час проведення нами усіх досліджень, зазнали гідролізу, і тому розташувалися у доріжках суцільним “шлейфом”. Однак, незважаючи на це, можна стверджувати що діаліз та хроматографія все-таки пройшли вдало, ы нам вдалось виділити білки, хоч і не зовсім вдалось розділити між собою фракції альбумінів та глобулінів. Таеож не можемо визначити молекулярні маси білків, оскільки, БСА. Який використовувався в якості маркеру. Не проявився на електрофорезі