Гель-фільтрація

Для розділення білків часто використовують хроматографічні методи, які базуються на розподілі речовин між двома фазами, одна з яких є рухомою, інша ж нерухома. В основу хроматографічних методів закладені різні принципи: гель-фільтрації, йонного обміну, адсорбції, та ін..

Метод розділеня білків за допомогою гель-фільтраційної хроматографії базується на тому, що речовини, які відрізняються за молекулярною масою, по-різному розділяються між рухомою та нерухомою фазами. Таким чином, за допомогою цього методу можна швидко розділити білки у відповідності з їхніми розмірами та формою молекул.

Носієм для хроматографії є гель, що складається з поперечно-зшитої тривимірної молекулярної сітки сформованої у вигляді гранул. Найчастіше використовують сефадекси. Сефадекси (se paration pha rmacia dex tran) - це продукти взаємодії полісахарида декстрана з епіхлоргідрином (рис.2.).

Рис.2. Структура сефадекса

Сефадекси є стійкими до дії органічних розчинників, розчинів лугів, і розбавлених кислот, а також нерозчинні у воді. Завдяки великому вмісту гідроксильних груп, гранули сефадекса легко набухають у водному середовищі, або ж у буферному розчині, з утворенням гелю, яким і заповнюють хроматографічну колонку. Чим вища здатність геля до набухання, тим вищий номер сефадекса. Робочий діапазон рН складає 2-10. Існує декілька типів сефадексів, які різняться між собою за розмірами, кількістю та величиною гранул. При розділенні суміші білків використовують сефадекси тонкого або супертонкого зерніння (G-100, G-250). Чим менші частини гелю, тим ефективніше проходить розділення

Нерухома фаза - це рідина всередині гранул сефадекса, в яку можуть проникати низькомолекулярні речовини і білки з невеликою молекулярною масою. Суміш білків, що наносять на хроматографічну колонку, вимивають, пропускаючи через колонку розчинник. Разом з фронтом розчинника рухаються і молекули білків, з великою молекулярною масою і розмірами, які не дифундують всередину зерен сефадекса. Таким чином - вони першими вимиваються із колонки. Більш дрібні молекули дифундують всередину гранул сефадекса і на деякий час попадають в нерухому фазу, в результаті чого їх рух сповільнюється (рис.3.). Величина пор визначає розмір молекул, які можуть проникати всередину гранул.

Рис. 3. Схема гель-хроматографії на колонці з сефадексом.

(Великі кружечка з хрестиком - зерна сефадекса, малі чорні і червоні кружечка та трикутники - білки з різною молекулярною масою)

А- колонка на початку роботи

Б, В, Г - колонка в різні періоди роботи. (розділення білкових компонентів в залежності від молекулярної маси та величини молекул).