Области применения сайт-специфической рекомбинации.

В настоящее время описанные выше системы сайт-специической рекомбинации широко используются для разного рода модификаций ДНК как в эукариотах, так и в прокариотах. При этом сайт-специфическая рекомбинационная система имеет некоторые преимущества, так как позволяет проводить сайт-направленные изменения хромосомы, такие как специфические делеции, дупликации и инверсий ДНК, а также специфические интеграции генетического материала. Среди сайт-специфических рекомбинационных систем Flp система 2-микронной плазмиды дрожжей и Cre-lox система бактериофага P1 являются наиболее привлекательными для геномных манипуляций из-за их эффективности, простоты и функциональной активности у большого диапазона организмов, таких как: бактерии, дрожжи, насекомые, растения, мыши и человек (Fukushige S., Sauer B., 1992; Baubonis W., Sauer B. 1993; Sauer B., 1994; Bernet A. et al, 1995; Leslie N.R., Sherratt D.J., 1995; Medberry S.L. et al, 1995; Ramirez S.R. et al, 1995). Сайт-специфическая рекомбинация, катализируемая Flp рекомбиназой легко происходит в бактериальных клетках (Huang L.C. et al, 1991; Posfai G. et al, 1994). Однако, для генетических манипуляций в бактриях эта система используется значительно меньше, чем в эукариотах, хотя бактерии были первыми недрожжевыми клетками, в которых продемонстрировали Flp-рекомбинацию. Главным образом Flp используют в E.coli в для изучения структуры и функций генов.

Одной из областей применения сайт-специфической системы является получение протяженных хромосомных делеций. В отличие от гомологичной рекомбинации, так же используемой для получения делеций, эффективность сайт-специфической рекомбинации не падает при увеличении длины делетируемого участка. Метод заключается во введении в хромосому двух рекомбинационных сайтов, фланкирующих область делеции. При расположении на одной молекуле ДНК двух сайтов, образующих прямой повтор, и индукции рекомбиназы, можно получить делецию фрагмента ДНК, фланкированного рекомбинационными сайтами (Yu B.J. et al, 2002) (Рисунок 1.10.). Этот же самый подход может быть использован для быстрого молекулярного клонирования протяженных фрагментов ДНК методом прямого вырезания-амплификации. Как известно, молекулярное клонирование является мощным инструментарием, например, для картирования генов или сиквенирования длинных фрагментов. Однако процедуры по клонированию могут быть трудоемкими и имеют ряд ограничений. Чужеродная ДНК или кодируемые этой ДНК продукты могут быть токсичными для клетки или могут претерпевать ряд модификаций. В результате селекции наиболее часто отбираются клоны, содержащие делетированную или модифицированную ДНК. Кроме того, некоторые системы для клонирования накладывают ограничения на размер клонируемых фрагментов, что затрудняет, например, секвенирование длинных фрагментов ДНК.

Рисунок 1.10. Схема конструирования хромосомных делеций. P1 и P2 – N-концевой и C-концевой делеционные праймеры, соответственно. H1 и H2 – короткие фланговые области, гомологичные участкам, окружающим область делеции.

Методом прямого вырезания-амплификации основывается на генетических манипуляциях in vivo и выражается в получении целевого фрагмента ДНК из клеток в амплифицированной кольцевой форме. Такой процесс позволяет преодолеть проблемы правильности копирования фрагмента и лимитации по размеру клонируемого фрагмента. Основная идея метода заключается во введении в хромосому двух сайтов, распознаваемых сайт-специфической рекомбиназой, на расстоянии до 100 kb вместе с условно-реплицирующимся ori. Штаммы, несущие такие вставки в хромосоме, стабильны до тех пор, пока не произойдет активации сайт-специфической рекомбиназы и репликативного белка, специфичного к ori, находящихся на плазмиде «помощнике» под строгим генетическим контролем, что предотвращает преждевременные, летальные для клетки, вырезание и амплификацию фрагмента. Метод позволяет получить автономно реплицирующуюся молекулу, содержащую фрагмент хромосомы длиной 50-100 kb, фланкированный сайтами рекомбинации. Как правило, такие системы основываются на элементах бактериофага P1 (Cre-lox) и дрожжевой системы (Flp-FRT) (Sternberg N., 1990; Pó sfai G. et al, 1994).

В настоящее время широкое применение сайт-специфическая рекомбинация приобрела в связи с созданием систем вырезаемых маркеров. При конструировании безмаркерных штаммов-продуцентов с большим количеством геномных модификаций, важной проблемой является возможность селективного отбора рекомбинантного штамма из-за ограниченного набора селективных маркеров. Как известно, в ряде стран введены законодательные ограничения на использоване в промышленности штаммов-продуцентов, содержащих гены антибиотической устойчивости. Решением задачи конструирования безмаркерных штаммов стала разработка системы, позволяющей удалять маркер антибиотической устойчивости из модифицированного штамма, благодаря наличию сайтов рекомбинации на его концах. После отбора рекомбинантного штамма на селективной среде, при обеспечении экспрессии соответствующей рекомбиназы, маркер может быть легко удален из хромосомы. Следующие этапы хромосомной модификации можно проводить при использовании того же самого антибиотического маркера. Были созданы различные системы вырезаемых маркеров антибиотической устойчивости на основе различных систем сайт-специфической рекомбинации. Как правило, это системы – Cre-lox фага P1, дрожжевая система Flp-FRT и система на основе элементов бактериофага λ (Dale E.C., Ow D.W., 1991; Cherepanov P.P., Wackernagel W., 1995. Posfai G. et al, 1999; Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000; Каташкина Ж.И. и др., 2005). Системы Cre-lox и Flp-FRT не требуют каких-либо хозяйских факторов или Xis-подобных белков, что выгодно отличает эти рекомбинационные системы от λ и λ -подобных систем, которые так же обеспечивают эффективное целевое изменение ДНК, но предполагают наличие специфических белков, что затрудняет их использование в других организмах. Однако, после использования Cre-lox и Flp-FRT рекомбинационных систем в хромосоме остается активный рекомбинационный сайт, способный участвовать в последующих актах рекомбинации. Это может привести к дополнительным хромосомным перестройкам при повторном использовании системы. В связи с этим, наиболее перспективным является использование маркера, фланкированного сайтами attL и attR фага λ (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997 (Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997). После Int/Xis зависимого вырезания маркера в хромосоме остается сайт attB, неактивный с точки зрения рекомбинации в отсутствие в клетке сайта attP. Это позволяет использовать этот же самый или аналогично устроенный маркер для последующих модификаций хромосомы. Описанные выше системы вырезаемых маркеров часто используются для получения направленных делеций генов (Baba T. et al, 2006). Еще одним примером использования системы вырезаемых маркеров для получения делеций различных генов является применение рекомбинационной системы XerC/XerD (Bloor A.E., Cranenburgh M.R., 2006). Инсерционная кассета состоит из гена антибиотической устойчивости, фланкированного dif сайтами, распознавемыми природной сайт-специфической рекомбиназой XerC/XerD. Кассета фланкирована последовательностями, гомологичными целевому локусу хромосомномы. Было показано, что дополнительный dif сайт может использоваться для разрешения димеров, только если он расположен в области 30 т.п.н. dif -активности. То есть введение dif сайтов в любую область хромосомы отличную от области активности природного dif сайта не будет сказываться на разрешении мультимерных репликонов. После интеграции кассеты в выбранный хромосомный локус за счет гомологичной рекомбинации, рекомбиназа действует таким образом, что вместо двух однонаправленных dif сайтов остается только один рекомбинантный dif сайт, и происходит выщепление антибиотического маркера. В результате, в хромосоме оказывается одновременно два сайта dif (один природный dif сайт и один dif сайт, оставшийся после выщепления антибиотического маркера), что может в дальнейшем привести к редким делециям участков хромосомы, заключенных между природным и дополнительным dif сайтами.

Сайт-специфические системы рекомбинации используются для эффективной сайт-направленной интеграции целевой ДНК в бактериальную хромосому. Наглядными примерами систем для сайт-направленной интеграции могут служить, например, FLIRT-система на основе элементов 2-микронной дрожжевой плазмиды и сайт-специфическая система рекомбинации бактериального транспозона Tn7. Рассматриваемые системы просты и позволяют быстро, легко и эффективно модифицировать бактериальную хромосому. FLIRT-система (Huang L.C. et al, 1997) состоит из трех элементов: 1) штаммов E.coli, в каждом из которых случайным образом локализованы единичные FRT сайты; 2) Flp-рекомбиназы, индуцируемой для введения целевой ДНК в FRT сайты в бактериальной хромосоме; 3) вектора для клонирования фрагмента ДНК, содержащего для селекции маркер антибиотической устойчивости и FRT сайт, идентичный FRT сайту, расположенному в бактериальной хромосоме. Сайт-специфическая интеграция в данном случае однозначно определяется экспрессией Flp белка и наличием FRT сайтов в хромосоме. Еще одним примером использования сайт-направленной рекомбинации является метод, базирующийся на сайт-специфическом рекомбинационном механизме транспозона Tn7. В отличие от большинства транспозонов, которые встраивиются в хромосому случайным образом, Tn7 предпочтительно встраивается в единственный хромосомный сайт att Tn7 (Barry G.F., 1988) и не вызывает инактивации генов хозяина. Было показано, что этот сайт локализован в межгенной области за геном glmS в некоторых Gram-отрицательных бактериях, включая E.coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, P. Putida, Yersinia pestis. Свойство встраиваться только в определенный сайт att Tn7 имеет огромное практическое значение, так как позволяет конструировать серии изогенных штаммов, отличающихся только природой интегрируемой ДНК. Обычно, система состоит из двух плазмид, где гены, необходимые для транспозиции, располагаются in trans на плазмиде-помощнике, а интегрируемая ДНК в составе mini-Tn7 – на второй плазмиде (Bao Y. et al, 1991). Система может состоять из одной плазмиды (McKenzie G.J., Craig N.L., 2006), где целевой ген встраивается в плазмидный MCS (Multiple Cloning Site), окруженный сайтами, распознаваемыми транспозазой, а элементы, необходимые для транспозиции Tn7, располагаются за фланкирующими целевой ген концами транспозона, что предотвращает интеграцию этих генов в хромосому во время транспозиции. Как правило, плазмида имеет температуро-чувствительный репликон, который позволяет элиминировать ее из клетки после интеграции целевой ДНК. Было показано, что эффективность встраивания экзогенной ДНК в составе интегративного вектора в att Tn7 является достаточно высокой.

Для интеграции генов в бактериальную хромосому в единичной копии может быть использована CRIM-система, разработанная в лаборатории Wanner (Haldimann A., Wanner B.L., 2001). Эти системы основываются на применении условно-репликативных CRIM-плазмид (conditional replication, integration and modular), содержащих фаговый attP. За счет наличия в составе интегративной плазмиды фагового attP, она может быть интегрирована в бактериальный attB сайт или выщеплена из него при наличии фаговой системы белков Int/Xis, расположенной in trans. Разработанная система включает attP и attB сайты бактериофагов λ, HK022, φ 80, P21, P22 и набор антибиотических маркеров. CRIM-плазмида интегрируется с помощью сайт-специфической рекомбинации в один из бактериальных att, интегранты при этом отбираются по устойчивости к антибиотику. Так как CRIM-плазмиды содержат различные гены устойчивости к антибиотикам, они могут быть использованы совместно в одной и той же клетке.