Оптимизация экспрессии генов искусственных оперонов

С момента открытия оперонной организации генов [ Jacob и др., 1960 ] минуло полвека, однако до сих пор на счет главного эволюционного фактора, определяющего преимущество объединения генов в такие структуры, нет ясных представлений [ Sneppen и др., 2010 ]. Для прикладной молекулярной биологии, и метаболической инженерии в частности, неоспоримым преимуществом конструирования искусственных оперонов является возможность контроля экспрессии группы генов за счет контроля транскрипции с одного промотора. Однако если уровни экспрессии каждого цистрона в природном опероне эволюционно оптимизированы, то такая оптимизация экспрессии генов искусственного оперона на сегодняшний день все еще является не тривиальной задачей. Вариантов ее успешного решения предложено также довольно ограниченное количество. Возможно, такая скудность подходов оптимизации связана с тем, что до недавнего времени в биотехнологии больший акцент делался на максимальную амплификацию целевых генов и оперонов в частности, нежели на оптимизацию их экспрессии. Однако амплификация оперона, клонирование его в состав плазмиды или введение многих его копий в хромосому, не решая проблему, приводит к перерасходу клеточных ресурсов, уменьшая показатель продуктивности штаммов.

Классическая схема конструирования искусственного оперона предполагает последовательное клонирование в вектор фрагментов, содержащих кодирующие части целевых генов с последовательностями SD. Такой метод на сегодняшний день не позволяет заранее предположить конечную эффективность сконструированного оперона. В то же время его длительность и трудоемкость резко ограничивает возможности варьирования различных генетических факторов, влияющих на скоординированную экспрессию цистронов. Как следствие полученные данным методом искусственные опероны зачастую не оптимальны с точки зрения целевого метаболического пути. Стабильность мРНК [ Arraiano и Maquat, 2003 ] и эффективность трансляции [ de Smit и van Duin, 1994 ] – наиболее важные факторы, определяющие эффективность экспрессии цистронов оперона. Предложенные на сегодняшний день методы оптимизации напрямую или косвенно влияют именно на них.

Первый метод основывается на использовании библиотеки синтетических, настраиваемых межгенных участков (t unable i nter g enic r egion (TIGR)) [ Pfleger и др., 2006 ]. Предложенный авторами способ явился результатом многолетних исследований влияния межцистронных структур на процессинг и стабильность сегментов транскрипта [ Smolke и др., 2000, Smolke и Keasling, 2002 ]. В работе была создана библиотека синтетических ДНК, состоящих из трех функциональных элементов, конкретная нуклеотидная последовательность каждого из которых в значительной степени варьировалась. Первый элемент был локализован посредине и представлял собой сайт процессинга РНКазыЕ, которая, как полагают, играет основную роль в деградации молекул РНК [ Deana и Belasco, 2005 ]. Второй и третий элементы фланкируют сайт процессинга и являются участками, формирующими вторичную структуру РНК, «шпильку». При этом «шпилька» формирующаяся на 5' конце дистального цистрона может маскировать его сайт связывания с рибосомой [ de Smit и van Duin, 1994 ]. Клонируя набор TIGR (~10⁴ различных вариантов) в целевую межгенную область оперона, за счет разной стабильности мРНК цистронов и разного уровня инициации трансляции дистального цистрона можно получить широкий набор соотношений экспрессий двух соседних генов (см. рис. 1.6).

Рисунок 1.6. Принцип метода оптимизации искусственного оперона на основе TIGR элементов (из Pfleger и др., 2006)

Общим недостатком подхода, и авторы сами указывают его, является интеграция в межгенную область множества участков, формирующих «шпильки» РНК, которые, как известно, повышают вероятность терминации транскрипции [ Larson и др., 2008 ]. Данный факт увеличивает количество транскриптов проксимальных цистронов относительно дистальных и требует учета порядка следования генов в опероне при его изначальном конструировании. Однако неоспоримым преимуществом является получение множества различных соотношений экспрессии соседних цистронов за один акт модификации.

Еще два опубликованных на сегодняшний день способа оптимизации экспрессии цистронов искусственных оперонов предлагают варьировать порядок следования генов [ Nakagawa и др., 2010; Bikard и др., 2010 ]. Отличие работ состоит только в том, за счет чего комбинируются различные позиции цистронов. Так в первой работе [ Nakagawa и др., 2010 ] используется подход, получивший название OGAB (O rdered G ene A ssembly in B .subtilis) [ Tsuge и др., 2003 ]. Варианты возможных комбинаций (N_{оперонов} = (n_{цистронов})!) закладываются на этапе конструирования оперона из отдельных цистронов, путем фланкирования их специфическими последовательностями (см. рис. 1.7).

Рисунок 1.7 (из Nakagawa и др., 2010). Схема оптимизации оперона методом OGAB

Во второй работе предлагается окружить цистроны оперона сайтами рекомбинации интегрона [ Biskri и др., 2005 ]. Впоследствии индуцируя экспрессию соответствующей интегразы, вызывать перетасовку in vivo генетических элементов фланкированных этими сайтами (см. рис. 1.8). Данный подход в отличие от предыдущего может приводить не только к изменению порядка, но и к дупликации цистронов в составе оперона.

Рисунок 1.8 (из Bikard и др., 2010). Схема оптимизации оперона посредством перетасовки цистронов

Среди молекулярных механизмов, приводящих к оптимизации экспрессии оперонов при их различном порядке следования, по-видимому, можно выделить минимум два: подбор оптимальной копийности цистрона, подбор оптимальной инициации трансляции цистрона. Относительно первого экспериментально показано, что количество транскриптов дистальных цистронов уменьшается по сравнению с проксимальными [ Nishizaki и др., 2007 ]. Подбор же оптимальной инициации трансляции есть следствие влияния различных последовательностей, лежащих выше сайта связывания с рибосомами. Однако данное объяснение менее вероятно для второго подхода, так как используются достаточно протяженные одинаковые межцистронные участки, сайты связывания с интегразой [ Bikard и др., 2010 ]. Интересную альтернативу описанным способам может предложить новый метод MAGE (M ultiplex A utomated G enome E ngineering) [ Wang и др., 2009 ]. Данный метод, являясь фактически циклически повторяющейся процедурой высокоэффективной Red-зависимой интеграцией олигонуклеотидов, содержащих целевые рандомизированные участки ДНК, позволяет осуществлять огромное множество сайт-специфических мутаций в кратчайшие сроки. Количество итоговых вариантов определяется лишь количеством циклов процедуры интеграции степенью рандомизации интересующих участков. Не вызывает сомнений, что его будущее использование значительно облегчит задачу оптимизации экспрессии цистронов искусственных оперонов.