Студопедия

Главная страница Случайная страница

Разделы сайта

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника






Flp-FRT система.






Flp-FRT сайт-специфическая рекомбинационная система, кодируемая 2 микронной дрожжевой плазмидой, встречающейся во многих дрожжевых штаммах Saccharomyces cerevisiae. Flp-белок – член интегразного семейства рекомбиназ, участвующий в контроле копийности 2 микронной дрожжевой плазмиды (Senecoff J.F. et al, 1985; Bruckner R.C., Cox M.M., 1986; Sadowski P.D., 1995). Эта сайт-специфическая рекомбинационная система инвертирует уникальную последовательность, находящуюся между повторами в 599 н.п., содержащими FRT сайты. In vivo анализ показал, что примерно 65 н. из 599 н.п. необходимы для функционирования рекомбинационного сайта (Luetke K.H., Sadowski P.D., 1998.). Минимальный рекомбинационный FRT-сайт для эффективной Flp-рекомбинации in vitro составляет не более 28 н.п., которые включают часть двух 13 н. инвертированных повторов и весь 8 н. центральный район (спейсер) между ними. Шесть нуклеотидов внутри спейсера не принимают участия в связывании или распознавании рекомбиназой, поэтому считается, что основными сайтами связывания для Flp рекомбиназы являются фланкирующие центральный район последовательности. Однако было показано, что центральная AT пара в ядре важна для связывания Flp-рекомбиназы и, следовательно, для эффективного участия FRT-сайта в рекобинации. Эффективность рекомбинации уменьшается, если размер спейсера в одном из рекомбинационных сайтов увеличивается или уменьшается на 1 нуклеотид, в то время как спейсер во втором сайте остается без изменений. Рекомбинация между двумя сайтами с одинаковой 1 н. вставкой или делецией в спейсере является, однако, достаточно эффективной. Этот результат показывает, что парность сиквенсов в спейсерной области важна для Flp-рекомбинации. В то же время, увеличение нуклеотидной последовательности спейсера на два нуклеотида приводит к полной утрате функциональности этого сайта. Это еще раз указывает на то, что рекомбиназа связывается с двумя короткими повторами, фланкирующими спейсер, и происходит важное белок-белковое взаимодействие. Изменение последовательности в этих сайтах приводит к уменьшению эффективности рекомбинации. Flp рекомбиназа разрезает ДНК вокруг 8 н. региона, оставаясь ковалентно связанной с этой областью через 3’-P тирозиновую связь и высвобождая 5’-OH группу с другого конца 8 н. области. Во время рекомбинации происходит ДНК-ДНК спаривание между двумя спейсерами. Это спаривание влияет не только на эффективность реакции, но и на ее результат. Направленность Flp-рекомбинации in vitro между двумя рекомбинационными сайтами, расположенными на одной молекулеДНК (инверсия или делеция) (Senecoff J.F. et al, 1985; Luetke K.H. et al, 1997) определяется расположением двух рекомбинационных сайтов относительно друг друга.

1.3.3.4. λ Int/Xis система.

Сайт-специфическая система рекомбинации фага λ обеспечивает интеграцию его ДНК в бактериальную хромосому (Landy A., 1989). Интеграция происходит путем рекомбинации между особыми att- сайтами: attP в хромосоме фага и attB в хромосоме бактерии. В результате рекомбинации образуются два гибридных сайта attL и attR с левой и правой стороны профага. Эти четыре типа att- сайтов функционально отличаются, что определяется их способностью рекомбинировать друг с другом. Было показано, что attP и attB имеют общее ядро в 15 н.п. и являются неравноценными. Первый устроен сложно. При размере около 250 н.п. он состоит из центральной части О (“core”) и двух примыкающих частей Р и Р’ (Рисунок 1.9.). Внутри сайта располагаются участки связывания с интегразой Int, которая обеспечивает обмен нитями между фаговым и бактериальным сайтами attP и attB во время интеграции, фаговым белком Xis, который обеспечивает вырезание профага и работает совместно с Int, а также с бактериальными белками IHF и Fis.

 

 

Рисунок 1.9. Структура attP и attB сайтов фага λ. C, C’, B, B’ – сайты связывания белка Int в ядре; P1, P2, P1’, P2’, P3’ – плечевые сайты связывания белка Int; H1, H2, H’ – сайты связывания белка IHF; X1, X2 - сайты связывания белка Xis; F - сайт связывания белка Fis. участвуют в интеграции;

участвуют в вырезании.

 

Было показано, что Р-плечо в РОР’ – не менее 106 н.п., но не более 152 н.п. Это хорошо согласуется с результатами Hsu et. al (Hsu P.-L. et al, 1980), которые показали, что специфический сайт связывания с Int белком находится между -129 и -148 н.п. Р’-плечо длинее, чем 68 н.п., но не более 99 н.п., что согласуется с данными Ross et. al (Ross W. et al, 1979), которые показали, что сайт связывания Int располагается между +50 и +86 н.п. Сайты связывания Int делятся на две группы, определяющиеся последовательностью и ролью, которую они играют в рекомбинации (Lee E.C. et al, 1990; MacWilliams M., 1997). Сайты связывания белка Int в ядре (C и C’ - для attP и B и B’ – для attB) фланкируют область обмена нитями в каждом att сайте. Белок Int, связываясь с этими сайтами, способствует синапсису между партнерскими att- сайтами и обеспечивает стадии разрыва и сшивки, в результате которых образуются рекомбинантные сайты. Вторая группа последовательностей ДНК, с которой белок Int связывается – это плечевые сайты. Сайт attP включает пять плечевых сайтов для связывания белка Int: P’1, P’2, P’3, P1, P2 (Рисунок 1.9.). Мономер бека Int имеет два ДНК связывающих домена, с помощью которых он распознает два класса связывающих сайтов. N-концевые 64 а.к. распознают плечевые (“arm”) связывающие сайты, в то время как С-конец белка необходим для распознавания “core”-связывающих сайтов (MacWfiams M.P. et al, 1996). Была продемонстрирована высокая аффинность Int белка к плечевым сайтам. И наоборот, сродство Int белка к “core”-связывающим сайтам в отсутствии “arm”-сайтов – слабо. Сайт attP включает три IHF связывающих сайта (H1, H2 - в Р-плече и H’ – в Р’-плече). Сайт связывания IHF (H’) расположен между ядром и плечевыми сайтами. Белок IHF изгибает ДНК перед связыванием H’ сайта таким образом, что белок Int, связывающий плечевые сайты, может одновременно взаимодействовать с центральными сайтами для образования сложной нуклеопротеиновой структуры - интасомы, что необходимо как для интегративной, так и для эксцизибельной рекомбинаци.

Сайт attB устроен проще. Его размер всего 31 н.п., центральная часть О (“core”) из 15 н.п. гомологична центральной части attP, в которой имеются два сайта связывания с интегразой. Различный размер attP и attB сайтов отражает различия в размере негомологичных фланкирующих последовательностей (Р, P’, B, B’). Было показано, что если последовательность Р и Р’-плеч будет короче, то attP может работать как attB сайт, то есть будет рекомбинировать с attP сайтом.

 






© 2023 :: MyLektsii.ru :: Мои Лекции
Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав.
Копирование текстов разрешено только с указанием индексируемой ссылки на источник.