Сайт-специфические рекомбинационные системы, наиболее часто применяемые для модификации бактериального генома.

1.3.3.1. XerC/XerD система.

Сайт-специфическая рекомбинационная система Xer E.coli вовлечена в процесс стабильного наследования мономерных репликонов в клетке. Образующиеся в результате гомологичной рекомбинации мультимерные репликоны разрешаются до мономеров рекомбиназами XerC и XerD (Hayes F., Sherratt D.J., 1997). Белковый сиквенс XerC и XerD, совпадающий на 37%, показал, что обе рекомбиназы являются членами λ -интегразного семейства сайт-специфических рекомбиназ. При разрешении хромосомных димеров рекомбиназы XerC и XerD кооперативно связываются с сайтом dif (Blakely G. et al, 1991; Blakely G.W., Sherratt D.J. 1994), расположенным в области терминации репликации бактериальной хромосомы и запускают процесс рекомбинации. В E.coli рекомбиназы XerC и XerD необходимы не только для рекомбинации в хромосомном dif сайте, но также участвуют в рекомбинации в ряде сайтов, расположенных на плазмидах ColE1, ColE3, pSC101, ColK. Структурная организация этих рекомбинационных сайтов схожа со структурой рекомбинационных сайтов loxP, FRT и сайтом, принимающим участие в λ -сайт-специфической рекомбинации. Ядро рекомбинационного сайта разделено на два 11 нуклеотидных полусайта, которые фланкируют 6-8 н.п. центральной области (Рисунок 1.8). Показано, что XerC связывается с левой половиной рекомбинационного сайта, в то время как XerD связывается с правой половиной. Это связано с определенной нуклеотидной последовательностью, которая является определяющей для распознавания каждой рекомбиназой. Сравнение последовательностей рекомбинационных Xer-связывающих сайтов показывает, что только три позиции внутри левого полусайта включают основания, которые не являются эквивалентными основаниям в правом полусайте. Для примера, позиция «-10» - всегда GC пара и никогда AT, в то время как «+10» - всегда AT (Рисунок 1.8.).

Рисунок 1.8. Последовательности для некоторых известных Xer-рекомбинационных сайтов. XerC-связывающий сайт менее консервативный, чем XerD. Сайты: cer – ColE1; psi – pSC101; clf –Clo DF13; dif – хромосома E.coli; ColK и ColE3 – из соответствующих плазмид.

Кроме того, показано, что позиции 10, 11, 13 важны для специфического узнавания и связывания XerD. Возможное взаимодействие сайт-белок – это двустороннее функциональное взаимодействие, где каждая рекомбиназа может распознавать «внешние» уникальные последовательности и использовать «внутреннюю» двойную симметрию для взаимодействия с общей белковой структурой. Наиболее похожие области XerC и XerD (73%) – это предполагаемый каталитический домен II, содержащий Tyr.

Связывание обоих белков является высоко кооперативным процессом (Arciszewska L.K., Sherratt D.J., 1995; Blakely G.W., 1997). Наличие двух рекомбиназ является необходимым условием для обеспечения ассиметрии при корректном отжиге рекомбинационных сайтов перед тем, как произойдет первый обмен цепями. Показано, что для рекомбинации in vivo обязательно наличие активных сайтов связывания для обоих белков, что доказывает участие обоих белков в процессе расщепления нитей и реакции переноса цепей (Blakely G. et al, 1993).