Тема: Морфология и ультраструктура прокариотов. Сложные методы окраски

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Освоить теоретический материал по теме занятия. Знать сущность и назначение сложных методов окраски: по Граму, по Бурри-Гинсу, Нейссеру, Ожешко, Циль-Нильсену. Иметь представление о различных видах микроскопии.

ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Структура бактериальной клетки (обязательные и необязательные структурные компоненты).

2. Методы для изучения величины и структуры бактериальной клетки.

3. Оболочка, строение. Цитоплазматическая мембрана, строение, функция.

4. Клеточная стенка бактерий. Различия в строении клеточной стенки Грам+ и Грам- бактерий. Функция клеточной стенки.

5. Капсула бактерий, ее роль, методы выявления.

6. Споры, их значение, стадии образования, условия для спорообразования, способы выявления.

7. Жгутики. Методы изучения подвижности. Инжектисома, строение, функция.

8. Нуклеоид, функция, методы выявления нуклеоида.

9. Сложные методы окраски (по Граму, Нейссеру, Бурри-Гинсу, Ожешко, Циль-Нильсену).

10. Принципы фазово-контрастной, темнопольной, люминисцентной микроскопии.

11. Понятие о конфокальной, электронной, атомно-силовой микроскопии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Лекционный материал.

2. Учебник «Медицинская микробиология» под редакцией проф. Д.К. Новикова, проф. И.И. Генералова, 2003, 2010 стр. 26-35.

3. «Практикум по медицинской микробиологии» С.А.Павлович, 1993, стр.6-7, 13-19.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:

1. Приготовление мазков из смеси сарцины и кишечной палочки, окраска по Граму в модификации Синева.

2. Микроскопия демонстрационного препарата дрожжей для выявления зерен волютина, окраска по Нейссеру.

3. Микроскопия демонстрационного препарата споровых бактерий, окраска по Ожешко.

4. Микроскопия демонстрационного мазка с капсульными бактериями, окраска по Бурри-Гинсу.

5. Зарисовка препаратов.

6. Конфокальная микроскопия препарата, окрашенного акридиновым оранжевым, для выявления нуклеоида.

7. Изучение подвижности в фазово-контрастном микроскопе

ПРЕПАРАТ №1ПРЕПАРАТ №2

смесь E.coli и Sarcina flava Капсула у бактерий

окраска по Граму окраска по Бурри-Гинсу

ПРЕПАРАТ №3ПРЕПАРАТ №4

Зерна волютина в дрожжах Споры В. anthracoides

окраска по Нейссеру окраска по Ожешко

Способы окраски:

I. Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную карболово-спиртовым раствором генцианового фиолетового и сверху капают несколько капель дистиллированной воды на 1-2 мин.

2. Убирают фильтровальную бумагу и, не промывая водой, наносят раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают спиртом – 30 секунд.

4. Тщательно промывают водой.

5. Докрашивают водным раствором фуксина 1-2 мин., промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: Гр(+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, Гр(-) бактерии – в розовый.

II. Окраска по Бурри-Гинсу:

1. Каплю взвеси микробов смешивают с каплей туши на обезжиренном стекле и готовят мазок шлифованным краем стекла, как мазки крови, высушивают, фиксируют.

2. Наносят водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: на темном фоне туши видны неокрашенные светлые капсула, внутри которой – красные бактерии.

III. Окраска по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок наносят 0, 5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 мин.

2. Кислоту сливают, промывают мазок, просушивают, фиксируют в пламени горелки.

3. Через фильтровальную бумагу наносят карболовый фуксин Циля, подогревают над пламенем горелки до трехкратного появления паров.

4. Снимают бумагу, промывают водой.

5. Обесцвечивают мазок 5% раствором серной кислоты 1-2 мин.

6. Промывают водой.

7. Докрашивают метиленовым синим 3-5 мин.

8. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий.

IV. Окраска по Нейссеру:

1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

2. Наносят раствор Люголя на 10-30 секунд.

3. Промывают водой.

4. Докрашивают раствором везувина или хризоидина 0, 5-1 мин.

5. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: зерна волютина окрашиваются в темно-синий цвет, цитоплазма бактерий – в желто-коричневый.