Хроматографические методы анализа молочных и мясных продуктов, продуктов переработки плодов и овощей

Хроматография — это способ разделения веществ, основанный на различии в их коэффициентах распределения между двумя фазами, одна из которых неподвижна, а другая направленно движется относительно первой. Характерными признаками хроматографии являются: наличие достаточно большой поверхности раздела между фазами и динамический способ выполнения разделения (направленное движение одной фазы относительно другой). Сочетание этих двух признаков делает хроматографию высокоэффективным методом разделения, позволяющим отделять друг от друга очень близкие по своим свойствам вещества, даже такие, как изотопы элементов или оптически активные изомеры. Если отсутствует хотя бы один из этих признаков, нет и хроматографии как эффективного метода разделения.

Создателем хроматографического метода анализа является русский ученый М. С. Цвет, который в 1903 г. разработал хроматографический метод разделения компонентов красящего вещества зеленых листьев растений (хлорофилла).

В своем основополагающем эксперименте Цвет экстрагировал красящее вещество листьев растений петролейным эфиром. Этот экстракт он ввел в стеклянную трубку, заполненную карбонатом кальция, сквозь слой которого непрерывно отфильтровывался петролейный эфир. В результате произошло разделение смеси на ряд зеленых и желтых полос (рис. 4.1).

Возрождение метода относится к 1931 г, когда Кун, Вин-терштейн и Ледедер выделили а- и В-каротин из сырого каротина, используя для этого метод Цвета.

Широкое применение хроматография получила в начале 40-х гг. XX в. после работы Мартина и Синга, предложивших представлять хроматографическую систему как некоторое число теоретических тарелок и создавших распределительный вариант хроматографии.

В 1950-е гг. появились первые газовые хроматографы, в которых для повышения эффективности разделения газообразных веществ применяли длинные колонки, заполненные мелкозернистым сорбентом. С тех пор хроматография широко используется во всем мире в различных областях исследования. Техника хроматографического разделения постоянно развивается и совершенствуется.

Хроматографические методы широко применяются при оценке пищевых продуктов, при проведении сертификационных испытаний. Они позволяют проводить исследования, не выполнимые другими инструментальными методами.

По правилам сертификации продуктов детского питания в перечень показателей, подлежащих подтверждению при обязательной сертификации, включены аминокислоты — треонин, валин, метионин, изолейцин, лизин, фенилаланин, триптофан, гистидин, цистин, которые определяются хроматографическим методом.

Газожидкостная хроматография является незаменимой при идентификации растительных масел по жирнокислотному составу, при определении хлорорганических и фосфорор-ганических пестицидов, летучих нитрозаминов; газовая хроматография — при анализе аромата пищевых продуктов; жидкостная — при определении антибиотиков, гормональных препаратов.

Степень применения для анализа пищевых продуктов разных методов хроматографии отражена на рис. 1. Метод газовой хроматографии (ГХ) применяется наиболее широко.

С его помощью определяют жирнокислотньй и триглицеридный состав пищевых продуктов, различные виды пестицидов, гербицидов и инсектицидов, ароматические и полиароматические соединения, проводят анализ спиртов и спиртосодержащей продукции, образцов воздуха и промышленных газов, лекарственных препаратов. Преимущества метода газовой хроматографии: простота проведения измерений, он идеален для анализа газовых проб, возможность использования широкого спектра хроматографических колонок и детекторов, большое количество методических материалов; недостатки: неприменим для анализа высокомолекулярных соединений, не используется для соединений, которые имеют высокую температуру кипения, требуется тщательная пробоподготовка исследуемого объекта, очень ограниченно применим для образцов, содержащих воду, и т.д.[4] Довольно значительно количество стандартизованных методик выполнения измерений (МВИ) с применением метода ГХ привело к его широкому использованию (44 % относительно других видов методов хроматографии). Данное обстоятельство свидетельствует и о хорошем развитии отечественного приборостроения, так как на рынке доминирующее положение занимает отечественное аналитическое оборудование.

В настоящее время разработан проект стандарта на определение аминокислот в молоке и молочных продуктах методом газовой хроматографии.

Метод основан на количественном определении триптофана при разделении на хроматографической колонне в газовой фазе с применением пламенно – ионизационного детектора.

Стандарт позволит количественно проводить измерения аминокислоты триптофана в молочных продуктах, так как данная аминокислота относится к незаменимым аминокислотам и необходим, для нормального функционирования организма. Одним из наиболее перспективных методов является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) он находит широкое применение для анализа пищевых продуктов, измерения внесенных ингредиентов, пищевых добавок, консервантов и красителей, определения витаминов и аминокислот, высокомолекулярных соединений и белков, а также для идентификации значительного количества объектов.

Преимущества метода: простота, возможность анализа молекулярно – массового распределения, использования широкого спектра хроматографических колонок и детекторов, широкий выбор модулей позволяет гибко решать любые аналитические задачи при постоянном прецизионном контроле всех частей системы документированием их работоспособности.

К недостаткам ВЭЖХ можно отнести: ограниченное применение для объектов с высоким значением рН, а также для ионогегенных и сильнополярных соединений; несколько ограниченная эффективность разделения; тщательная пробоподготовка объекта для исследования. Но преимущества метода значительно перекрывают его недостатки. Подготовлен проект стандарта на определение консервантов и красителей методом ВЭЖХ, который позволяет проводить измерение консервантов (бензоиной, сорбиновой, пропионовой кислоты и их солей) и синтетических красителей (индигокармина, желтого «Солнечный закат», тартразина, понсо 4R, изорубина и т.д.). Метод основан на экстракции консервантов и красителей анализируемой пробы и их количественном определении с помощью ВЭЖХ с применением обращенофазовой колонки и спектрофотометрического детектора.

Этот стандарт значительно расширит возможности применения хроматографических методов для контроля качества молока и продуктов его переработки, позволит проводить измерения содержания консервантов и красителей в продуктах переработки молока.

На рис. 2 представлена хроматограмма стандартной смеси из пяти красителей, наиболее часто применяемых в пищевой промышленности. Хроматограмма получена с применением ВЭЖХ с защитной колонкой длиной 250 мм, внутренним диаметром 4, 6 мм, заполненной обращенофазовым сорбентом с привитыми октадецильными группами размером частиц 5 мкм; колонка длиной 125 мм, внутренним диаметром 4 мм. На хроматограмме видно, что по времени удерживания красители распределяются следующим образом: индигокармин, желтый «Солнечный за­кат», изорубин, тартразин и понсо 4R. Данное обстоятельство позволяет с хо­рошей воспроизводимостью определять содержание красителей в молочных составных и молокосодержащих продуктах, а также проводить четкое дифференцирование и идентификацию продуктов переработки молока по составу и биологической ценности.

Метод ВЭЖХ применяется для определения лизина и цистеина в молоке, молочных продуктах и продуктах детского питания на молочной основе.

Методическая база представлена методическими указаниями (МУК 4.1.2420-08) и разрабатываемым совместно IDF и ISO стандартом NC 34/SC № 744. Данные методики характеризуются практически сходными процедурами проведения измерений, но несколько отличаются по пределам обнаружения лизина и цистеина (для РФ - 1 мг/кг, для IDF и ISO -0, 5 мг/кг). Эффективность метода ВЭЖХ подтверждается большим набором статистических данных, полученных в испытательных лабораториях разных стран мира. Хорошие возможности ВЭЖХ по точности и прецизионности получены в результате применения стандартных образцов анализируемых веществ.

Хроматографию, реализующую ионообменный механизм разделения в сочетании с кондуктометрическим детектированием разделяемых компонентов, принято называть ионной хроматографией (ИХ). Это аналитический метод с комбинацией ионообменных колонок с детектированием по электропроводности.

На практике применяют два различных метода: с химической супрессией, которая предполагает химическое подавление фоновой проводимости; прямой хроматографии (ионная хроматография с электронным подавлением фона), в которой используются элюенты с низкой концентрацией солей органических кислот на ионообменниках с очень низкой емкостью. Ионная хроматография сегодня в мире является арбитражным методом анализа при исследовании состава неорганических анионов водных растворов.

Обладая поистине фантастической воспроизводимостью (например, анализ семи основных неорганических анионов F С Вг NO2 NO3 НРО4 SO4- возможен менее чем за 10 мин), ИХ отличается минимальной инструментальной погрешностью и высокой воспроизводимостью результатов. Метод ИХ широко используется для экологического мониторинга питьевой и сточной воды, количественного анализа примесных ионов контроля сырья и готовых продуктов в пищевой промышленности, анализа требуемых по рецептуре ионов и т.д. Методы ионной хроматографии практически не применяют для анализа молочных продуктов, что, вероятнее всего, связано с особенностью ионной хроматографии, которая основана на свойстве подвижных ионов сорбента вступать в обменные реакции с ионами обмывающего раствора. Сложная молочная матрица приводит к невозможности разделения ионов в анализируемой смеси и влиянию различных факторов на протекание процесса хроматографирования.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) – наиболее широко распространенный метод разделения сложных смесей в аналитической практике.

Принцип разделения основан на перераспределении компонентов между подвижной фазой и слоем адсорбента, нанесенным на носитель (стеклянную пластину, фольгу). В качестве сорбента чаще всего используется силикагель, в том числе с модифицированной поверхностью. Детектирование осуществляется визу­ально (качественный анализ), для количественного анализа используются спектрофотометры ультрафиолетовой и видимой области. Идентификация пробы осуществляется с использованием эталонных веществ.

Особенности применения ТСХ - легкая совместимость с другими методами (ВЭЖХ- ВЭТСХ, ВЭТСХ-МС и т.п.), широкий выбор готовых аппликаций по различным областям применения: от анализа пищевых продуктов до экологического контроля. Применение тонкослойной хроматографии для контроля показателей безопасности в молоке и продуктах его переработки несколько снижается. На данный период стандартизован метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) по определению афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах, сорбиновой кислоты и ее солей, бензойной кис­оты и ее солей в пищевых продуктах.

Но при наличии более перспективных методов измерений данных параметров необходимость оценки с применением ВЭТСХ отпадает. Этот метод хорошо зарекомендовал себя в фармакопейной промышленности как рутинный метод анализа фармацевтических препаратов и сырья на содержание основного вещества, примесей и побочных веществ. Газожидкостная хроматография (ГЖХ) – разделение газовой смеси вследствие различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов. Неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на инертный носитель, подвижной - газ. Применяется для анализа различных компонентов и соединений.

В молочной промышленности метод ГЖХ нашел применение для идентификации жировой фазы продукта. ГОСТ Р 51471-99 «Жир молочный. Метод обнаружения газожидкостной хроматографией стеринов» позволяет определять стерины в выделенном из продукта жире. Метод подразумевает оценку хроматограммы и количественное определение стеринов (фитостеринов в продукте с содержанием растительных жиров и холестерина в продукте с содержанием животных жиров). Метод ГЖХ эффективен при разделении сложных органических, металлоорганических и биохимических систем (метод разделения). Кроме того, его можно использовать для завершения химического анализа.

В этом случае время или объем удерживания используют для качественной идентификации, а высота или площадь пика дает количественную информацию (в сущности данное обстоятельство использовано в ГОСТ Р 51471). Качественная идентификация компонента основана на величине промежутка времени от момента ввода пробы до момента записи вершины пика; количественные данные получают, вычисляя площадь пика. Введение в практику исследований открытых капиллярных колонок с пористым слоем позволило существенно увеличить разрешающую способность ГЖХ, что позволило применять этот метод для измерения стероидных гормонов, предварительной очистки препаратов и разделения смеси на классы.[5] Возможности совместного использования хроматографии и других видов инструментального анализа все больше расширяются.

Например, при применении хроматомасс-спектрометрии и газовой хроматографии появилась очевидная возможность измерения диоксинов, дибензофуранов и т.д. С использованием МС-детектора.

Соединение метода электрофореза и хроматографии (электрофоретическая хроматография) позволяет определять распределение смеси в соответствии с их абсорбционной способностью и подвижностью в электрическом поле. По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям XX столетия, которые преобразовали науку, а через нее определили и развитие промышленности.

Hи один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных) многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены более 1000 индивидуальных компонентов (например, в бензиновых фракциях нефти); двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или аминокислот в гидролизатах белков [6]. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стали возможными расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе «Геном человека». Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности полихлорированных диоксинон в объектах окружающей среды крайне низких концентрациях этих веществ (менее 1 мкг/кг). Развитие хроматографических методов анализа расширило возможности исследования молока и молочных продуктов, позволило проводить измерения по широкому перечню параметров, что послужило предпосылкой к разработке и совершенствованию методов анализ. 2.2. Спектрофотометрический метод анализа Спектрофотометрические методы основаны на способности аминокислот или продуктов их взаимодействия с определенными реагентами поглощать в УФ-области спектра.

Эта группа методов наиболее широко используется в настоящее время для количественного анализа аминокислот.[3] Растворы ароматических аминокислот (триптофана, фенилаланина, тиро-зина) поглощают в диапазоне 240–300 нм. На этом основании разработаны экспресс-методы их количественного определения, отличающиеся простотой.

Однако, вследствие того, что максимумы светопоглощения этих аминокислот близки, то в процессе количественного определения отдельных ароматических аминокислот возможны ошибки анализа.

Поэтому, в большинстве случаев, данный метод анализа является предварительным и требует дополнительного анализа с помощью ВЭЖХ, ГЖХ и аминокислотных анализаторов.

Разработан простой и точный спектрофотометрический метод анализа цистина (примеси цистеина в пищевых продуктах и молоке), основанный на способности его солянокислых растворов к светопоглощению при длине волны 250 нм. При изучении аналитических возможностей метода, установлено, что цистеин в это области не поглощает и не мешает определению цистина.[4] Учитывая важную биологическую роль цистеина (участие в реакциях трансаминирования, обмене серы в организме, в частности, в тканях хрусталика), разработка доступных методов его определения является важной аналитической задачей.

Так, разработана методика количественной оценки цистеина в биологических жидкостях, основанная на его окислительно-восстановительной реакции с солями железа (III) в присутствии 1, 10-фенантролина с последующим спектрофотометрическим определением продукта реакции.

Методика характеризуется высокой точностью определения и простотой исполнения С целью определения суммарного содержания аминокислот в молоке был разработан спектрофотометрический метод количественной оценки продукта реакции аминокислот с альдегидом ортофталевым. Продукт реакции определяют спектрофотометрически в присутствии меркаптоэтанола при длине волны 340 нм. Метод характеризуется высокой чувствительностью и позволяет количественно определить все аминокислоты, за исключением цистина, пролина.[3] 2.3.