Способ получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки глаза

Классификация по МПК: A61KA61P

Патентная информация

Патент на изобретение №: 2311914

Автор: Ямсков Игорь Александрович (RU), Ямскова Виктория Петровна (RU), Наговицын Анатолий Васильевич (RU), Краснов Михаил Сергеевич (RU)

Патентообладатель: Ямсков Игорь Александрович (RU), Ямскова Виктория Петровна (RU), Наговицын Анатолий Васильевич (RU), Краснов Михаил Сергеевич (RU)

Дата публикации: 10 Декабря, 2006

Начало действия патента: 30 Мая, 2005

Адрес для переписки: 119991, Москва, ул.Вавилова, 26, Институт биологии развития РАН, М.С. Краснову

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии. Способ заключается в том, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных макулярную область нейральной сетчатки, промывают и выдерживают ткань сетчатки в водно-солевом растворе, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3, 5-10, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, собирают фракции кислых белков, удаляют из них сахарозу и амфолины методом диализа, раствор белка высушивают и очищают электрофорезом в 7, 5-15%-ном полиакриламидном геле, затем с последующим элюированием в течение 2-5 дней при 4-7°С низкомолекулярной фракции Rf=0.7-0.9 деионизованной водой из геля, диализом в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа полученной фракции деионизованной водой, сушкой полученного регуляторного пептида и растворением его в физиологическом водно-солевом растворе. Изобретение обеспечивает повышение процента выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделение высокоочищенных полипептидов с низкой молекулярной массой.

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к офтальмологии.

Известно изобретение по патенту РФ №2232586 Офтальмологическое лекарственное средство и способ лечения заболеваний, патологических состояний и повреждений сетчатой оболочки глаза, МКИ 7 А61К 35/44, 38/17, А61F 9/00, A61P 27/02, приоритет от 23.04.2003 г.

Изобретение заключается в следующем: офтальмологическое лекарственное средство, включающее препарат сетчатки и фармацевтически приемлемый носитель, заключающееся в том, что оно содержит в качестве препарата сетчатки гликопротеин, выделенный из сетчатки глаза млекопитающих, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку ниже 3, 0 и кажущуюся молекулярную массу от 8 до 200 кДа и, возможно, хлористый кальций.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, основная часть регуляторных пептидов выпадает в осадок, в связи с растворением экстрактов ткани в насыщенном растворе сульфата аммония, большая молекулярная масса белков.

Известно изобретение по патенту РФ №2073518 Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, МКИ 6 А61К 35/44, А61F 9/00, приоритет от 17.06.93 г.

Изобретение заключается в следующем: средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученных из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработки надосадочной жидкости ацетоном.

Однако данное изобретение обладает существенными недостатками: они не используют ткани макулярной области нейральной сетчатки, высокая концентрация полипептидов в препарате, используется комплекс низкомолекулярных полипептидов, нет высокой степени очистки препарата.

Техническая задача, решаемая предлагаемым изобретением, заключается в том, что используют области нейральной сетчатки, содержащие наибольшее количество биохимически и физиологически активных белков и полипептидов, что позволяет повысить процент выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделять высокоочищенные полипептиды с низкой молекулярной массой.

Указанная техническая задача решается тем, что в способе получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки глаза из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют макулярные области нейральной сетчатки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают ткань сетчатки в водно-солевом растворе при 4-7°С в течение 2-4 часов, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3, 5-10, 0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после этого собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 10-14 дней. Полученный при этом водный раствор белка высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7, 5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0, 7-0, 9, содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют деионизованной водой в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Наиболее активными концентрациями пептида являются 10^-10-10^-12 мг/мл.

Способ характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+7°С и давлении 730 мм рт.ст. в течение 4 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 2500g 10 мин при Т=20°С и давлении 730 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3, 5-10, 0 при температуре +6°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1, 0-3, 0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 14 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 7, 5%-ном полиакриламидном геле при Т=25°С и давлении 730 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0, 7), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 5 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа в течение 10 дней при Т=+4°С, давлении 730 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl ₂, 1 мМ KCl - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl ₂, 0, 4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре 20°С и давлении 730 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-9 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре 20°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0, 22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 2 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Высокоочищенные препараты получают после очистки методом электрофореза и проверяют методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте вода/ацетонитрил на колонке С8: при детекции с длиной волны 280 нм гомогенный препарат элюируется с колонки с временем удержания 3-4 мин.

Пример 2.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз крыс ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре 25°С и давлении 760 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl ₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl ₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+4°С и давлении 760 мм рт.ст. в течение 3 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 15 мин при Т=25°С и давлении 760 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале рН 3, 5-10, 0 при температуре +4°С и напряжении 500-2000 В в течение 96 часов, собирают фракции кислых белков (интервал рН=1, 0-3, 0), объединяют их, диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 8 кДа до полного удаления сахарозы и амфолинов в течение 10 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., далее полученный водный раствор белка лиофильно высушивают на лиофильной сушке до получения сухого вещества, лиофилизат, представляющий собой белый хлопьевидный мелкодисперсный порошок, далее фракционируют с помощью метода электрофореза в нативных условиях в 15%-ном полиакриламидном геле при Т=+25°С и давлении 760 мм рт.ст., собирают низкомолекулярную фракцию (Rf=0, 9), содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 4 дней при T=+7°C, давлении 760 мм рт.ст., полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания 2 кДа в течение 7 дней при Т=+7°С, давлении 760 мм рт.ст., отдиализованный белковый раствор далее повторно высушивают лиофильно до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, для приготовления лекарственного средства из препарата регуляторного пептида, полученного после электрофореза, приготавливают исходный раствор пептида, растворяя сухой лиофилизованный порошок регуляторного пептида в физиологическом водно-солевом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ KCl - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl на 1 л деионизованной воды), концентрацию регуляторного пептида в исходном растворе определяют с помощью колориметрического метода с использованием бицинхониновой кислоты, растворы регуляторного пептида в концентрациях, соответствующих 10^-1-10 ^-9 мг/мл, приготавливают путем последовательного разбавления в физиологическом растворе в 10 раз исходного раствора, при постоянном встряхивании после каждого разведения, при температуре +25°С и давлении 760 мм рт.ст., затем в 100-миллилитровую мерную колбу вносят 10 мл р-ра регуляторного пептида в концентрации, соответствующей 10^-8 мг/мл, и далее прибавляют физиологический раствор (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, на 1 л деионизованной апирогенной воды) до объема 100 мл и перемешивают при температуре +25°С, полученный раствор разливают во флаконы в стерильных условиях, используя фильтры для холодной стерилизации с размером пор 0, 22 мкм, в асептических условиях стерильного бокса и ламинарного потока воздуха. Конечный выход активного пептида получают равным 1 мг из 50 глаз сырого продукта, после очистки методом электрофореза получают пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%.

Пример 3.

Выделяют из свежеэнуклеированных глаз 7-, 14-, 19-дневных куриных эмбрионов ткани макулярной области нейральной сетчатки при температуре +23°С и давлении 745 мм рт.ст., промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl ₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl ₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды), выдерживают ткани макулярной области нейральной сетчатки в водно-солевом растворе (0, 15 М NaCl, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES - 8, 75 г NaCl, 0, 111 г CaCl₂, 0, 4 г KCl, 0, 238 г HEPES на 1 л дистиллированной воды) при Т=+5°С и давлении 745 мм рт.ст. в течение 2 часов, центрифугируют тканевой экстракт при 3000g 10 мин при Т=23°С и давлении 745 мм рт.ст., осуществляют сбор надосадочной жидкости и разделяют ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы в интервале