Стабильность генов

Оказалось возможным показать также, что гены, неиспользуемые в дифференцированных клетках, при определенных условиях могут быть активиро-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ______________ 93

Рис. 10.16. Активация молчащих генов при слиянии соматических клеток. Слияние тетраплоидной опухолевой клетки из печени крысы и диплоидного фибробласта мыши приводит к образованию гибридной клетки, которая экспрессирует гены мыши, специфичные для печени.

ваны и что они могут продуцировать белки, специфичные для клеток других типов. Убедительные данные о реактивации неиспользуемых генов у млекопитающих были получены в лаборатории Μ эри Вейс (Peterson, Weiss, 1972; Brown, Weiss, 1975) при использовании методики слияния дифференцированных клеток различных типов. Клетки могут сливаться естественным образом (как в случае развития мыши), или их можно искусственно стимулировать к слиянию, воздействуя такими агентами, как инактивированный вирус Сендай (вирус мышиной кори) или полиэтиленгликоль¹. При слиянии клеток возникает ситуация, при которой два ядра оказываются в обшей цитоплазме (рис. 10.16). В благоприятных условиях оба ядра гибридной клетки одновременно войдут в митоз и в результате образуют гибридное ядро, содержащее хромосомы из родительских клеток обоих типов. В большинстве случаев, когда клетки двух различных типов сливаются друг с другом, полученный гибрид теряет свойства, характерные для родительских клеток. В результате слияния опухолевых клеток из печени крысы с фибробластами мыши Вейс смогла получить гибриды, содержащие два набора хромосом из печени на один набор из фибробластов. Эти клетки сохранили способность синтезировать белки, специфичные для печени крысы, такие, как альбумин, альдолаза и тирозинаминотрансфераза (ТАТ). Более удивительно, что кроме этих белков они синтезировали также мышиные альбумин, альдолазу и ТАТ – три белка, которые никогда не синтезируются фибробластами. Фибробласты мыши сохранили гены, специфичные для печени, в форме, которая допускает их экспрессию в определенных условиях. Эта ситуация соответствует общему правилу развития животных: в процессе дифференцировки клеток необратимых генетических изменений не происходит.

Нарушение стабильности геномов: изменения в генах лимфоцитов

Использование методов молекулярной биологии позволило выявить интересное исключение из сформулированного выше правила; исключение это – дифференцировка лимфоцитов. В соответствии с общим правилом неиспользуемые гены присутствуют в дифференцированных клетках и сохраняют способность к функционированию. Набор генов одинаков во всех тканях. Геном же каждого типа лимфоцитов отличается от генома любых других типов клеток в организме, в том числе и от геномов других типов лимфоцитов. Примером такого рода являются В-лимфоциты клетки, которые синтезируют антитела.

Антитела образуются, когда чужеродный субстрат (антиген) приходит в контакт с В-лимфоцитами, находящимися в лимфатических узлах и селезенке. Еще до контакта с антигеном в каждом из

¹ В последнее время широко используется слияние клеток или их фрагментов в электрическом поле. – Прим. ред.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

94________________ ГЛАВА 10 ______________________________________________________________________________

Рис. 10.17. Модель клональной селекции для формирования антител. Поверхность В-лимфоцитов приобретает свою специфичность до контакта с антигеном. В клеточной мембране имеются антитела лишь одного типа. В-лимфоциты, у которых связанные с мембраной антитела присоединили антиген, пролиферируют, продуцируя клоны плазматических клеток, которые секретируют антитела с той же самой специфичностью, что и поверхностные антитела, связавшие антиген. (По Edelman, I970.)

покоящихся В-лимфоцитов синтезируются молекулы антител, однако из клеток они не выделяются, а встраиваются в клеточные мембраны лимфоцитов. Каждый B-лимфоцит продуцирует антитела, которые узнают один и только один антиген. Таким образом, антитела, узнающие белковую оболочку вирусов полиомиелита, не будут узнавать холерный токсин, мембрану клетки Е. coli или вирус гриппа. После того как связанные с мембраной антитела присоединяют молекулы определенного антигена, В-лимфоцит многократно делится и дифференцируется в плазматическую клетку, секретирующую антитела (рис. 10.17 и 10.18). (Механизм этой дифференцировки будет подробно рассмотрен в гл. 16.) К размножению и секреции антител стимулируются только те В-лимфоциты, которые обладают способ-

Рис. 10.18. А. В-лимфоцит. Б. Плазматическая клетка. Обратите внимание на расширение сети шероховатого эндоплазматического ретикулума, когда B-лимфоцит становится плазматической клеткой, секретирующей антитела. (Фотографии с любезного разрешения L. Weiss.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

_____________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ_______________________ 95

Рис. 10.19. Структура типичного иммуноглобулина (антитела). Две идентичные тяжелые цепи соединены дисульфидными связями. Антиген-связывающий сайт формируется из вариабельных областей (белые) тяжелой и легкой цепей, тогда как эффекторный сайт антитела (контролирующий способность антител агглютинировать с антигенами, присоединяться к макрофагам или входить в состав слизистых секретов) определяется аминокислотной последовательностью константной области (серая) тяжелых цепей.

ностью связывать данный антиген. В соответствии с этой моделью, названной теорией клональной секреции (Burnett, 1959), каждый B-лимфоцит приобретает присущую ему специфичность до контакта с антигеном. Иными словами, из миллионов различных видов антител, которые каждый В-лимфоцит может производить, он «выбирает» только один вид и размещает антитела этой специфичности на своей клеточной поверхности.

Механизм этой селекции по специфичности антител включает образование новых генов в ходе дифференцировки B-лимфоцитов. Белок антитела на клеточной поверхности состоит из двух пар полипептидных субъединиц (рис. 10.19): двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Цепи связаны друг с другом дисульфидными связями. Специфичность молекулы иммуноглобулина (т.е. избирательность связывания с вирусом полиомиелита, клеткой Е. coli или какими-либо другими молекулами) определяется последовательностью аминокислот в вариабельной области. Эта область формируется из амино-концов одной тяжелой цепи и одной легкой цепи. Вариабельные области молекул иммуноглобулинов присоединены к константным областям, которые придают антителу его эффекторные свойства. Например, константная область тяжелых цепей молекул поверхностных иммуноглобулинов удерживает эти белки в клеточной мембране.

ФОРМИРОВАНИЕ ГЕНОВ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ АНТИТЕЛ. Гены для легких и тяжелых цепей лимфоцитов разделены на сегменты. Гены легких цепей состоят из трех сегментов (рис. 10.20). Первый сегмент гена кодирует вариабельную (V) область легкой цепи. Она содержит около 300 различных последовательностей, которые кодируют в общей сложности пер-

Рис. 10.20. Перестройка генов легких цепей в ходе развития В-лимфоцитов. До стимуляции антигеном один из 300 или большего числа V-сегментов гена объединяется с одним из пяти J-сегментов гена и сближается с константным (С) сегментом гена.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

96________________ ГЛАВА 10 ______________________________________________________________________________

Рис. 10.21. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. ДНК, разрезанная рестриктазой Ват HI, помещается в карман геля. В электрическом поле мелкие фрагменты движутся быстрее, чем крупные. После разделения фрагментов (на основе их размеров) гель разрезают и фрагменты ДНК элюируют для последующей гибридизации.

вые 97 аминокислот легкой цепи антитела. Второй сегмент, J-область, состоит из четырех или пяти возможных последовательностей ДНК для последних 15—17 остатков вариабельной части легкой цепи антитела. Третий сегмент определяет константную (С) область легкой цепи. В ходе развития В-лимфоцита одна из трехсот V-областей и одна из пяти J-областей комбинируются друг с другом и образуют вариабельную часть гена антитела. Это достигается перемещением последовательности V-области к последовательности J-области перестройки, которая сопровождается удалением промежуточной ДНК.

О такой перестройке гена впервые сообщалось в работе Хозуми и Тонегавы (Hozumi, Tonegawa, 1976). Эти исследователи выделили ДНК из зародышей мыши и опухолевых B-клеток, секрети-

(см. след. страницу) Рис. 10.22. Протокол и результатыопыта Хозуми и Тонегавы. ДНК из эмбриональных клеток мыши и В-клеток по отдельности гидролизовали рестриктазой Ват HI, фракционировали с помощью электрофореза и элюировали из гелей. Каждый элюированный препарат ДНК после денатурации гибридизовали или с полной мРНК. кодирующей вариабельную и константную области легкой цепи иммуноглобулина, или с фрагментом мРНК, кодирующим только константную область легкой цепи белка (3'-конца). В случае эмбриональной ДНК вариабельная и константная области легкой цепи белка были обнаружены в двух различных фрагментах ДНК (константная область располагалась на фрагменте с молекулярной массой 3, 9 х 106. а вариабельная область – на фрагменте ДНК с массой 6 х 106). В опухолевых лимфоцитах константная и вариабельная области располагались вместе на одном фрагменте ДНК, имеющем молекулярную массу 2, 4 х 106. (По Hozumi, Tonegawa, 1976.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

______________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ___________________ 97

рующих легкие цепи ¹. Каждый из двух препаратов ДНК обрабатывали рестриктазой Bam HI, которая расщепляет в ДНК последовательность ГГАТЦЦ, где бы она ни находилась. В результате были получены серии фрагментов ДНК. Размеры каждого фрагмента определялись длиной участка ДНК между двумя сайтами расщепления.

Полученные фрагменты ДНК наносили на край желеобразного плоского геля, через который пропускали электрический ток (рис. 10.21). При миграции ДНК к положительному электроду меньшие по размеру фрагменты двигались быстрее, чем ее крупные фрагменты, за счет чего достигалось эффективное разделение фрагментов по размерам. Гель с распределенной по нему ДНК разрезали на кусочки, каждый из которых содержал фрагменты ДНК определенного размера². Из каждого кусочка элюировали ДНК и денатурировали ее. Часть этой ДНК гибридизовали с радиоактивной РНК, которая кодирует полную легкую цепь и была изолирована из исходных опухолевых B-клеток. Другую часть гибридизовали с радиоактивной РНК, которая кодирует лишь С-область легкой цепи (фрагмент мРНК с 3'-конца). ДНК из клеток зародышей связывалась с мРНК легкой цепи в двух зонах геля. ДНК в первой зоне имела молекулярную массу около 6 млн. дальтон, тогда как ДНК во второй зоне – 3, 9 млн. дальтон. При гибридизации ДНК зародышей мыши с мРНК для С-области легкой цепи эта РНК связывалась лишь с ДНК из зоны с молекулярной массой 6 млн. Таким образом, в зародышах мыши С-область кодируется внутри фрагмента ДНК с молекулярной массой 6 млн. (между сайтами Bam HI ). тогда как V-область кодируется внутри фрагмента с массой 3, 9 млн. (рис. 10.22).

Принципиально иной результат был получен для ДНК из опухолевых лимфоцитов. Единственная зона ДНК, связывающая мРНК легкой цепи, имела молекулярную массу 2, 4 млн. Кроме того, эта зона связывала фрагмент мРНК, кодирующий С-область легкой цепи. Оказалось, что обе области, С и V, кодируются одним и тем же фрагментом ДНК! Простейшее объяснение, которое было многократно подтверждено в других лабораториях и с помощью иных методов (см. Brack et al., 1978; Bernard el al., 1978; Seidman ei al., 1979), заключается в том, что два фрагмента гена, один из которых кодирует С-область легкой цепи и другой – специфичную V-область легкой цепи, соединились вместе, образовав новый ген. Новый ген возник в ходе развития лимфоцита. Предложенная авторами схема образования такого гена показана на рис. 10.23.

ФОРМИРОВАНИЕ ГЕНОВ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ АНТИТЕЛ. Гены тяжелых цепей антител содержат даже боль-

¹ Опухолевые клетки были использованы потому, что они синтезируют огромное количество определенного иммуноглобулина (и мРНК для этого иммуноглобулина).

²Размер ДНК в каждом кусочке геля определяли по миграции фрагментов ДНК с известной длиной на параллельной дорожке.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

98________________ ГЛАВА 10 ______________________________________________________________________________

Рис.10.23. Модель перестроек в ДНК при переходе от эмбриональных клеток к В-лимфоцитам по данным Хозуми и Тонегавы. (Hozumi, Tonegawa, 1976.)

шее число сегментов, чем гены легких цепей. Сегменты гена тяжелой цепи включают V-область (200 различных последовательностей для первых 97 аминокислот). D-область (10-15 различных последовательностей для 3-14 аминокислот) и J-область (четыре последовательности для последних 15–17 аминокислот V-области). Следующий фрагмент – это С-область. Вариабельная область тяжелой цепи формируется в результате присоединения одной V-последовательности и одной D-последовательности к одной из J-последовательностей (рис. 10.24. А, Б). Эта VDJ-последовательность вариабельной час-

Рис. 10.24 Формирование вариабельной области гена и переключение классов при синтезе тяжелых цепей иммуноглобулинов. Ген тяжелой цепи содержит три области, которые объединяются вместе для формирования вариабельной области (V, D и J), и константную область (С). Четыре главных класса антител различаются по константной области (IgAсодержит Cα; IgM – Cμ; lgG – С γ; IgE – Cε). До встречи с антигеном вариабельная область формируется объединением V-, D- и J-сегментов. Этот VDJ-сегмент гена сближается с константной μ -областью, и полученное антитело встраивается в клеточную мембрану. После встречи с антигеном участок ДНК может образовать петлю таким образом, что VDJ-сегмент сближается с другой константной областью (в данном случае С константной α -областью, которая позволяет антителам войти в состав слизистых секретов). В этом переключении классов участвуют группы последовательностей-переключателей (S), прилежащих к каждой из константных областей.(По Davis et al., 1980a.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ________________ 99

ти далее присоединяется к первой С-области тяжелойцепи, специфичной для антител, которые могут быть встроены в плазматическую мембрану. Таким образом, молекулы антител формируются двумя генами, возникающими в ходе антигеннезависимой стадии развития В-лимфоцита. Эти молекулы встраиваются в клеточную мембрану и служат рецепторами антигенов.

ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ КЛАССОВ В ГЕНАХ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ. После стимуляции антигеном В-клетка делится и дифференцируется в плазматическую клетку секретирующую антитела. Вначале антитела, синтезируемые этими клетками, содержат ту же С-область, что и ранее. Однако при дальнейшем синтезе антител С-область может измениться. Исходную С-область называют константной мю-областью (Cμ). Следующая С-область та, что содержится в секретирующих антителах, может остаться μ -областью ( хотяи с модификацией, которая обеспечивает секрецию), но может также стать гамма(γ)эпсилон(ε)- или альфа(α)-константной областью. Таким образом, один и тот же вариабельный участок тяжелой цепи может соединяться вначале с константной μ -областью, а позже, например, с константной γ -областью. Это явление называется переключением классов. (Класс тяжелых цепей антител определяет характер их функционирования: μ - и γ -цепи стимулируют лизис, агглютинацию или разрушение антигена макрофагами: ε -цепи вызывают воспалительный процесс, а α -цепи обеспечивают выделение антител в слизь, слезы, слюну и молоко.) Переключение классов осуществляется транслокацией полного сегмента вариабельной области гена (VDJ) из положения перед константной μ -областью в участок, примыкающий к константной γ -, ε - или α -области (рис. 10.24. В, Г). Этот процесс заключается в делеции сегмента константной μ -области гена из генома (Davis et al., 1980; Cory et al., 1980; Rabbits et al., 1980; Yaoita, Honjo, 1980).

Таким образом, геном плазматической клетки существенно отличается от генома любой другой клетки. Во-первых, в нем была создана последовательность вариабельной области гена посредством объединения различных сегментов ДНК. В клетках всех других органов эти сегменты ДНК разделены, а в В-лимфоцитах и плазматических клетках они собраны вместе. Во-вторых, во многих плазматических клетках часть генома (а именно ДНК из константной μ -области тяжелых цепей) элиминируется из ядер. Определенная часть генома утрачивается в ходе развития плазматической клетки: создаются новые гены, тогда как другие разрушаются.

Какие выводы можно сделать? Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что ядра дифференцированных клеток действительно сохраняют основную часть своей генетической информации в форме, которая допускает ее экспрессию в соответствующих условиях. Тем не менее очевидно, что по крайней мере при дифференцировке клеток одного типа происходит некоторая утрата генетического материала. Пока у нас нет возможности выяснить, каково разнообразие необратимых генетических изменений, которые могут происходить в процессе развития животных Однако известные нам сведения о перестройке генов в лимфоцитах указывают на то, что необратимые генетические потери являются следствием клеточной дифференцировки, а не ее причиной.

Дополнительные сведения и гипотезы: Изменения генов

Геном плазматических клеток дефицитен по определенным последовательностям ДНК, которые необходимы для дифференцировки. Клетки иммунной системы другого типа – Т-лимфоциты – также утрачивают часть генома при формировании рецепторов своего антигена (Fujimoto, Yamagishi, 1987). Но это лишь одна из форм генетической нестабильности. Известны и другие примеры (Borst, Greaves, 1987). Геном паразитического простейшего Trypanosoma brucei, вызывающего сонную болезнь, может меняться, чтобы продуцировать разные гликопротеины клеточной поверхности (благодаря этому паразит ускользает от иммунной системы хозяина). Сходный механизм, по всей вероятности, ответствен за изменение типа скрещивания у дрожжей (Hoeijmakers et al., 1980; Haber et al., 1980; Strathern et al., 1979). В этом случае каждая гаплоидная клетка содержит оба гена, определяющие тип скрещивания. Выбор типа скрещивания зависит от того, какой из этих генов занимает определенную позицию на хромосоме. Эти позиции переключаются в процессе деления клеток. Так, если в одном поколении ген типа скрещивания а находится в локусе «включено», то в следующем поколении в этом положении находится ген α, а ген а дожидается своей очереди по соседству.

В каждом из этих трех примеров фигурируют гены, ответственные за узнавание клеточной по-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

100 _______________ ГЛАВА 10 _____________________________________________________________________________

Рис. 10.25. Зерна кукурузы с пигментированными участками, сформированными клетками, в которых транспозон покинул область генов, образующих пигмент. Клетки в неокрашенных зонах не способны синтезировать пигмент, так как присутствующий транспозон продолжает инактивировать ген, ответственный за синтез пигмента. (По Peterson, I977; фотографии с любезного разрешения R. A. Peterson.)

верхностью. Это явление наблюдается в ходе всего развития позвоночных (часть III), поэтому не следует удивляться тому обстоятельству, что утрата тотипотентности была вызвана необратимыми изменениями генома.

В дополнение к уже описанным рекомбинантным событиям разнообразие антител может создаваться также в результате соматических мутаций. Было показано, что при дифференцировке В-клетки в плазматическую клетку происходит значительное количество точковых мутаций (Crews et al., 1981).

Мутации другого типа являются следствием встраивания в ген мобильных элементов (или транспозонов). Транспозоны представляют собой подвижные фрагменты ДНК, которые могут интегрироваться в различные части генома. Если мобильный элемент разрывает структурный ген, то ген инактивируется. Такая ситуация наиболее хорошо изучена на примере бактерий, кукурузы и дрозофилы. У кукурузы транспозон, встроившийся в ген окраски зерен или рядом с этим геном, вызывает образование бесцветных зерен (McClintock, 1952; Peterson, 1980). Однако после удаления транспозона из гена синтез пигмента восстанавливается. В результате наблюдается мозаичный фенотип (рис. 10.25). У дрозофилы мутация white-aprikot вызывается встраиванием мобильного элемента в область гена white (см. цветную таблицу на внутренней стороне обложки; Green, 1980; Gehring, Paro, 1980). До сих пор неизвестны случаи, когда подобные изменения в положении транспозонов управляют какими-либо процессами развития. Транспозоны могут встраиваться в геномную ДНК подобно тому, как встраиваются ретровирусы, и они могут быть использованы, подобно ретровирусам, для введения нового генетического материала в клетки дрозофилы (Spradling, Rubin, 1982).

Итак, ясно, что геном представляет собой динамическое целое и не является абсолютно стабильной структурой. Способность ядер к изменению явилась сюрпризом для многих биологов, однако она была предсказана основоположником генной теории Томасом Хантом Морганом. В 1927 г. Морган письменно свидетельствует, что «наиболее общим генетическим допущением является то, что гены остаются неизменными в продолжение всего времени [развития]». Он разъясняет, что «основа строения гена остается всегда одной и той же, а постулируемые добавления или изменения гена являются событиями такого порядка, которые происходят в протоплазме. Если последняя может изменяться при дифференцировке в новой окружающей среде, не утрачивая своих фундаментальных свойств, то почему этого не могут делать гены? Совершенно очевидно, что этот вопрос выходит за пределы имеющихся данных, но в качестве возможности его не следует отбрасывать. С ответом на этот вопрос следует подождать до того времени, пока не удастся получить экспериментальные данные».