Методы лабораторных исследований при инфекционных заболеваниях у детей

(микробиологический фрагмент)

Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях подразделяются на несколько групп: 1. Методы, основанные на выявлении инфекционных агентов (возбудителей): Микроскопические методы, базирующиеся на прямом наблюдении возбудителя в клинических образцах с помощью различных приемов микроскопии. Бактериоскопическое исследование применяется для обнаружения возбудителей в патологическим материале (крови, мочи, спинномозговой жидкости, слизи из зева и носа, кала и различных патологических субстратов), взятом от больного, с помощью обработки специальными красителями и наблюдения под микроскопом. Этот метод имеет довольно ограниченное применение в связи со сходством многих патогенных микроорганизмов и поэтому в большинстве случаев является вспомогательным методом. Он используется для обнаружения в крови возбудителей возвратного тифа, лептоспироза, в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) - менингококков, пневмококков и гемофильной палочки при бактериальном гнойном менингите (БГМ), в смыве из зева -дифтерийной паточки при дифтерии и спирохет - при ангине Симановского-Плаута- Винцента, холерных вибрионов - в кале при холере; лептоспир - в моче при лептоспирозе. Палочки характерной морфологии, например, чумы можно увидеть в пункгате чумного бубона и мазках-отпечатках, взятых из сибиреязвенного карбункула. При микроскопии мазка пунктата из костного мозга и селезенки, грануляций из язвы можно обнаружить лейшмании, в мокроте у больного пневмонией — возбудителей пневмонии. Преимущество бактериоскопического метода заключается в его быстроте. Результаты анализа могут быть получены через 1-1, 5 часа. При изучении микробиологических образцов чаще используют световую микроскопию, окрашенных препаратов под иммерсией (объектив х 90). Для индикации спирохет, боррелий и лептоспир в препаратах «висячей» или «раздавленной» капли применяют микроскопию в темном поле при помощи конденсора-параболоида. Фазово-контрастная микроскопия и метод анопторальной микроскопии используются для изучения нативных, без предварительной обработки бесцветных, прозрачных объектов (живых клеток и т.п). С помощью специального устройства конденсора и объектива разность фазовых колебаний, проходящих через биологический объект и окружающую среду световых волн, недоступных человеческому глазу, преобразуется в разность интенсивностей (амплитуд) света, благодаря чему детали строения объекта становятся видимыми. Люминесцентая микроскопия позволяет получить цветное изображение светящихся объектов на черном фоне с высокой степенью их контрастности с помощью люминесцентного микроскопа. Метод основан на феномене люминесценции (или флюоресценции), когда некоторые вещества под влиянием падающего света испускают лучи с другой длиной волны, что сопровождается изменением окраски исследуемого объекта.

2. Бактериологический (культуральный) метод диагностики является «золотым» стандартом микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, помогающим в установлении этиологического диагноза и выборе тактики этиогропной терапии. Метод основан на выделении возбудителя из крови, ЦСЖ, мокроты, слизи из зева и носа, кала, мочи, желчи больного, а при летальных исходах — из кусочков органов, которые засевают на специальные питательные среды. В зависимости от того, какой микроб предполагают выделить (что определяется при клиническом и эпидемиологическом обследовании больного), выбирают соответствующую питательную среду. Ценность результатов бактериологических исследований во многом определяется тем, правильно ли взят материал у больного, правильно ли он доставлен в лабораторию и соответствуют условия выделения и культивирования чистых культур физиологическим потребностям микроорганизмов. При инфекциях, вызываемых условно-патогенными бактериями,

выделение их из субстратов, в норме не являющихся стерильными (кал, моча, мокрота и др.), не рассматривается как безусловное доказательство этиологической роли этих микроорганизмов в генезе заболевания. Обсемененность эндогенной микрофлорой у больных значительно выше, чем у бактерионосителей. Поэтому при постановке диагноза заболеваний, вызванных условно-патогенными возбудителями, надо проявлять осторожность и исходить из 4 критериев: многократности обнаружения данных видов, массивности их роста в посевах на плотные питательные среды, антигенной и фаговаровой однородности выделяемых субкультур и диагностического нарастания ти гров гомологичных антител при серологических исследованиях.

Условия сбора, хранення и транспортировки проб биологических материалов. При взятии проб биологического материала для проведения микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила. Отбор материала следует производить до начала антибактериальной терапии и непосредственно из очага инфекции, при этом соблюдая правила асептики. При отборе проб использовать только стерильные тампоны (для отделяемого раны, мазков со слизистых оболочек, из глаза, уха, носа, зева, цервикального канала, и т.д.), транспортные среды (для отбора проб биологического материала из открытых полостей), шприцы (для крови, гноя, экссудатов), лабораторную посуду (для мокроты, мочи, фекалий). Количество материала должно быть достаточным, транспортировку проб нативного материала и траспортные среды с отобранными пробами должны доставляться в лабораторию не позднее чем через 1, 5-2 ч в специальных контейнерах (пеналах или биксах). Пробы биоматериалов для культивирования ряда микроорганизмов следует транспортировать в лабораторию, соблюдая дополнительные условия хранения и транспортировки образцов с учетом биологических особенностей предполагаемых возбудителей инфекций. Так. например, для строгих анаэробов - максимально защищать пробы от воздействия кислорода воздуха, для пневмококка - учитывая его способность к аутолизу, не задерживать сроки проведения посевов, для менингококка, гонококка - учитывая чрезвычайную лабильность к низким температурам, транспортировку осуществлять в специальных контейнерах с грелками (35-40°С) и т.д.

2. Методы, позволяющие обнаружить в биологическом материале продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Например, выявление экзотоксина палочки ботулизма в реакции нейтрализации (РН) на мышах или РНТ - реакции нейтрализации токсина in vitro, определение экзотоксина дифтерийной палочки иэкзотоксина типа А и В Clostridium difficile иммунофлюоресцентным методом на анализаторе «Vidas» и др.

3. Иммунологические методы - реакции обнаружения антигенов возбудителей в биологическом материале. Эту задачу лишь отчасти может разрешить реакция связывания комплемента (РСК). Более чувствительным методом Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РПГА) с антительным эритроцитарным диагностикумом относится к более чувствительным методам диагностики и широко применяется для диагностики дизентерии, сальмонеллеза и некоторых других инфекций. При этой реакции находящийся на поверхности танизированных эритроцитов специфический иммуноглобулин связывается с гомологичным антигеном. Эритроциты человека и животных (нативные и формалинизированные), предварительно обработанные танином, приобретают повышенную способность адсорбировать на своей поверхности белковые субстанции. В качестве адсорбентов кроме эритроцитов используются латекс, коллодий, бентонит и др. Реакция агглютинации латекса применяется для выявления антигенов пневмококков, палочки инфлюэнцы, менингококков. При положительной реакции частицы латекса выпадают в осадок. Практическое значение приобретает такой высоко чувствительный и специфичный метод определения бактериальных антигенов, как встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ). В последние годы для диагностики различных инфекций стала применяться реакция коагглютинации (РКоА). Это реакция между антигеном и антителами, фиксированными на поверхности золотистых

стафилококков, содержащих протеин А (компонент клеточной стенки - «Cowan i» большинства штаммов золотистых стафилококков). Последний обладает способностью соединяться с Fc-фрагментом Ig G. В результате образуется иммуносорбент по типу антительного диагностикума. который вступает в реакцию с гомологичным антигеном за счет свободных Fab-фрагментов иммуноглобулина. Визуально это выражается феноменом агглютинации стафилококка. В лабораторной практике широко применяют иммуиофлуоресцеитный метод Кунса или реакцию иммунофлюоресценции (синонимы реакция иммунофлюоресценции - РИФ. метод флюоресцирующих антител - МФА, прямая иммунофлюорценция - ПИФ) основан на выявлении светящихся иммунных комплексов. Сущность метода заключается в соединении антител, меченых флюорохромом, со специфическими антигенными детерминантами, находящимися на поверхности клетки, и последующей детекции с помощью люминесцентного микроскопа на определенной длине волны. В настоящее время повсеместно используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит образование комплекса " антиген-антитело" на твердой фазе полистирольных планшет и дальнейшая " трансформация" ферментной метки в соответствующий сигнал, регистрируемый с помощью спектрофотометра. Основными преимуществами метода являются: высокая чувствительность и специфичность, возможность одновременного исследования большого количества проб, объективная оценка результатов с помощью спектрофотометра, простота постановки и возможность внутреннего контроля при каждой постановке Ограничения метода связаны с наличием необходимого оборудования, высококачественных и высокоспецифичных тест-систем, а также с соответствующей квалификацией специалистов лаборатории. ИФА используется не только для определения антител, но и для выявления антигенов.ИФА является универсальным методом и позволяет выявлять в сыворотке (плазме) и в спинномозговой жидкости специфические антитела различных классов и субклассов (по общепринятой схеме чаще всего определяют антитела классов IgM и IgG). Самый чувствительный, позволяющий обнаружить малое содержание антигенов (0, 5 нг/мл), радиоиммунный метод, однако он требует специального оборудования. Перечисленные методы имеют ряд преимуществ перед бактериологическим. Это методы экспресс-диагностики, позволяющие определить антигены возбудителей в течение нескольких минут или часов. Несмотря на гибель бактерий после проводимой этиотропной терапии, антигены возбудителей могут персистировать в организме от 3 до 4 недель и выявляться данными методами. Тем не менее следует учитывать, что существует широкое антигенное родство между родами и видами внутри каждого семейства бактерий и даже среди различных семейств. Это может привести к получению ложноположительных результатов. Определение антигенов бактерий не позволяет установить чувствительность возбудителей к антибиотикам, что также снижает значимость этих методов.

4. Методы серологические - основаны на выявлении активного иммунного ответа в парных сыворотках крови, в динамике заболевания. Серологические реакции, направленные на поиск специфических антител в сыворотке крови больных бактериальными инфекциями, используются для постановки ретроспективного диагноза. Реакции считаются положительными в том случае, если титр их повышается при повторном исследовании в 4 раза и более. Диагностическую ценность имеют лишь определенные уровни антител. Например, для диагностики кишечных инфекций в РА (реакции агглютинации) и РПГА (реакции пассивной гемагглютииации) значение имеет титр 1: 320—1: 640 и выше (сальмонеллезы, дизентерия). При этом необходимо учитывать эпидемическую обстановку в данной местности и принимать во внимание «нормальный» уровень антител у здорового населения. В диагностике бактериальных инфекций используют РСК (рекция связывания комплемента), реакцию непрямого гемолиза, реакцию непрямой иммунофлуоресценции, непрямой иммуноферментный метод, реакцию нейтрализации и другие серологические методы. Серологические

реакции имеют лишь относительную достоверность, гак как могут быть неспецифическими или положительными у лиц, перенесших соответствующую инфекцию в прошлом (анамнестическая реакция), а также у получивших профилактические прививки (прививочная реакция). Для более объективной оценки результатов серологических исследований используют дифференцированное исследование антител различных классов иммуноглобулинов - IgM, IgA, IgG.

5. Генетические методы (полимеразная цепная реакция -ПЦР), основанные на обнаружении нуклеиновых кислот возбудителя в исследуемой проб биологического материала. ПЦР обладает уникальной чувствительностью и специфичностью. С ее помощью можно анализировать различные клинические образцы. Суть ПЦР заключается в идентификации специфического участка молекулы ДНК с последующим копированием или амплификацией этого участка с целью получения достаточного количества копий, которые могут быть выявлены доступными методами детекции (чаще всего с помощью электрофореза).

6. Неспецифические лабораторные тесты, по характеру отклонения которых можно заподозрить патологические изменения, характерные для инфекционных процессов бактериальной природы, например, тест на прокальцитонин, постановка которого осуществляется на анализаторе «VIDAS».

брюшной тиф. Возбудитель - сальмонелла группы D (Salmonella typhi) из рода Salmonella, семейства Enterobacteriaceae, грамотрицательная, подвижная палочка. паратиф а. Возбудитель- сальмонелла группы (Salmonella paratyphi А) из рода Salmonella, семейства Enterobacteriaceae, грамотрицательная, подвижная палочка. паратиф в. Возбудитель - Salmonella paratyphi В (Salmonella schottmuelleri) из рода Salmonella, семейства Enterobacteriaceae, грамотрицательная, подвижная палочка. В основе лабораторной диагностики тифо-паратифозный заболеваний лежат особенности патогенеза этих инфекций. Ведущим методом в специфической диагностике тифо- паратифозных заболеваний является выделение гемокультуры. Высокая температура тела у пациента свыше 5 дней обязывает провести посев крови на гемокультуру, желательно до начала антибактериальной терапии. Пробы крови на гемокультуру засевают в желчный бульон или среду Раппопорт в соотношении 1: 10 или исследуют в анализаторе «BacTALERT». На второй неделе заболевания исследуют фекалии и мочу с целью выделения копро- или уринокультуры. При неблагоприятных условиях (воздействие антимикробных средств, реакция иммунной системы) Salmonella typhi может трансформироваться в L-формы, способных к внутриклеточному длительному персистированию, что является основанием для использования сред на PPLO-основе для выделения атипичных форм возбудителя - ввиде L- форм и ФНР (форм насбалансированного роста).. Ретроспективная серологическая диагностика осуществляется в реакции агглютинации Видаля с О - и Н - диагностикумами. Основное диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом (диагностический титр - 1: 200 и выше). Для установления бессимптомного течения брюшного тифа назначают РИГА с Vi-антигеном. Методы ранней диагностики (ИФА, ВИЭФ, РИА и др.) основаны на выявлении антигенов возбудителя или антител к возбудителю.

САЛЬМОНЕЛЛЕЗ. К наиболее этиологически значимым для человека сальмонеллам относятся многочисленные возбудители из рода Salmonella, семейства Enterobacteriaceae: S. enteritidis, S. typhi murium, S. heidelberg, S. panama, S. infantis, S. newport, S. agona. S. derby, S. london и др. Для подтверждения клинического диагноза используются бактериологические и серологические методы исследования. Материалом для бактериологического исследования служат: кровь на гемокультуру (при генерализованных, септических формах), для выделения чистой культуры возбудителя. Пробы крови на гемокультуру засевают в желчный бульон или среду Раппопорт в соотношении 1: 10 или исследуют в анализаторе «BacTALERT», испражнения, моча, рвотные массы, промывные воды желудка, желчь, гной из очагов воспаления на дифференциально-диагностических средах - Эндо, висьмут-сульфит-агаре и др.. Серологические исследования исследуют в парных сыворотках крови: - в динамике заболевания в РИГА с использованием сальмонеллезных антигенных эритроцитарных диагностикумов. Ее минимальный диагностический титр - 1: 200. Ретроспективный серологический диагноз устанавливается при четыре- и более кратной сероконверсии.

ШИГЕЛЛЕЗ. Возбудители шигеллеза - грамотрицательные палочки из рода Shigella, семейства Enterobacteriaceae,, включающего 4 вида (четырех серогрупп А, В, С и D): Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei. В типовой вид Shigella dysenteriae в качестве отдельных сероваров входят палочки Григорьева-Шига, Штутцера-Шмитца, палочки Лардж-Сакса и др. Шигеллы Зонне, в свою очередь, разделяют на 7 ферментативных типов. Диагностика дизентерии основывается на результатах клинико-лабораторного обследования пациента. Большое диагностическое значение имеет осмотр кала, при котором можно обнаружить примесь слизи с прожилками крови. Лабораторное подтверждение дизентерии проводится бактериологическим (выделением возбудителя на среде Плоскирева и др. дифференциально-диагностических средах) и серологическим методами (РПГА с дизентерийным эритроцитарным антигенным диагностикумом). Выделение чистой культуры возбудителя при 3-кратном бактериологическом исследовании фекалий обеспечивает подтверждение диагноза у 40—60% больных. Ускоренная диагностика осуществляется высокочувствительными и специфическими методами выявления в биосубстратах (слюне, моче, кале и крови) антигенов возбудителей в ИФА, РАЛ, РКоА, РИФ (или НИФ) и определении специфической ДНК шигелл в ПЦР.

ЭШЕРИХИОЗЫ. Возбудители - грамотрицательные бактерии (Escherichia coli) из рода Escherichia, семейства Enterobacteriaceae. Диареегениые эшерихии дифференцируют от непатогенных по наличию факторов патогенности (адгезивность, инвазивность, способность к токсинообразованию, колициногенность). В соответствии с антигенной структурой и степенью выраженности перечисленных факторов патогенности эшерихии принято выделять 6 главных категорий патогенных эшерихий, вызывающих диарею: группа энтеропатогенных кишечных палочек (ЭПЭ, ЭГЖГ1, штаммы 018. 026, 044. 055, 086, 01 11, 0119. 0125, 0126, 0127, 0128, 0142) - вызывают заболевания у детей раннего возраста; группа энтероинвазивных кишечных палочек (ЭИЭ.ЭИКП, 028. 029, 032, 0112, 0124, 0136, 0143, 0144. 0151 «Крым», 0152,, 0164, 0167) - вызывают дизентерийно- подобные заболевания у детей и взрослых; группа энтеротоксигенных кишечных палочек (ЭТЭ.ЭТКП, 01, 06, 08, 09, 015, 020, 025, 027, 075, 078. 080, 0114. 01, 15, 0128 ас. 0148, 0153, 0159. 0169: 1141) - является причиной диареи путешественников; группа энтерогеморрагических эшерихиозов (ЭГЭ, ЭГКП, 0157: 117, 0103: Н2, 026: 111 1. 0145: НП) - вызывает геморрагический колит с гемолитико-уремическим синдромом; группа энтероаггрегационных кишечных палочек (ЭАЭ, EaggEC) - причина длительной (более 14 дней) диареи у младенцев и группа диффузно-адгезивных кишечных палочек (DAEC) - причина диареи у детей дошкольного возраста. Доказана роль в поражении ЖКТ трех патотипов E.coli: E.coli. вырабатывающие цитотоксический некротизирущий фактор, способный поражать не только ЖКТ, но и другие органы и системы, E.coli, вырабатывающие цитолетальный («вспенивающий») токсин, являются причиной диарей пых заболеваний по типу ЭПЭ у детей до 2 лет и эшерихии, «отделяющие клетки» - - вызывают вспышки диареи у детей в возрасте до 2 лет в развивающихся странах (Бразилии, Сомали, Нигерии). Лабораторная диагностика основана на использовании классического бактериологического метода - выделении штамма кишечной палочки на среде Эндо и гипировании чистой культуры возбудителя с помощью реакции агглютинации с антисывороткой. Исследованию подлежат фекалии, рвотные массы и кровь при подозрении на генерализацию. Несмотря низкую эффективность, метод выделения культуры кишечной палочки с последующим серотипированием является отправным методом для постановки современных высокоспецифичных тестов. Для определения фактора адгезии (EAF -плазм иды) ЭПЭ используют гест «локализованной адгезия бактерий к Нер-2 - клеткам» или тестов IЩР -диагностики и ДНК-зондов. Диагностика ЭТК11 строится на обнаружении в ИФА термолабильного энтеротоксина и термостабильного токсина, а также на определении токсинов в культуре гкани надпочечников или культуре ткани китайского хомяка. Эффективно также применение высокоспецифических тестов тестов Г1ЦР -диагностики и ДНК-зондов. Для идентификации энтерогеморрагических штаммов E.coli используют методы выявления цитопатического действия токсина на культуре клеток, для определения токсина Шиги используют ИФА или метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами (выявление генов, кодирующих токсин). Идентификация ЭАЭ проводится на культуре клеток Пер -2. образующих на зараженных клетках характерную агрегационную картину «кирпичной кладки».

ПСЕВДОТУЬЕРКУЛЕЗ. Возбудитель псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) - грамотри дательные палочковидные бактерии из рода Yersinia, семейства Enterobacteriaceae. Температурный фактор определяет изменчивость иерсиний, их устойчивость во внешней среде, размер клеток, темп размножения, скорость метаболических процессов. Лабораторная диагностика основана на использовании бактериологических, молекулярно-генетических и серологических методов. Материалом для исследования служат фекалии, рвотные массы, моча, кровь, ЦСЖ, желчь, синовиальная жидкость. Несмотря на невысокую эффективность прямого посева исследуемого материала на плотные питательные среды (как правило, на среде Серова), бактериологический метод целесообразно применять при групповых заболеваниях с обязательным предварительным проведением холодового обогащения на средах накопления (буферно-казеиново-дрожжевая среда с 1% пептонной „ водой). В практическом здравоохранении к эффективным методам ретроспективной серологической диагностики относятся: РНГА с эритроцитарным псевдотуберкулезным антигенным диагностикумом (Берлез*), РСК и ИФА. Положительным результатом серологического исследования парных сывороток крови в РНГА считается положительная или отрицательная «четырех - и более кратная» сероконверсия антител против Yersinia pseudotuberculosis К методам ускоренной диагностики относятся иммунологические реакции, основанные на выявлении антигенов Yersinia pseudotuberculosis в различных биологических жидкостях (в кале, сыворотке крови, моче и др.), РКоА, РАЛса, РНИФ и ИФА (на основе липополисахарида). Эффективно применение ГЩР-анализа для определения генетического материала возбудителя в кале, сыворотке крови и моче.

ИЕРСИНИОЗ. Возбудители иерсиниоза (Yersinia enterocolitica) - грамотрицательные полиморфные подвижные палочки из рода Yersinia семейства Enterobacteriaceae. Лабораторная диагностика основана на использовании бактериологических и серологических методов. Материалом для исследования служат фекалии, рвотные массы, моча, кровь, ЦСЖ, желчь, синовиальная жидкость. Для выделения чистой культуры иерсиний пробы фекалий, рвотных масс, мочи, ЦСЖ, желчи и синовиальной жидкости после предварительного холодового обогащения с использованием сред накопления (буферно-казеиново-дрожжевая среда с 1% пептонной водой) засевают на плотные питательные среды (агар Хоттингера, среда Мак-Конки, висьмут-сульфит- агар, агар с десоксихолатом натрия, питатальный агар с бромтимоловым синим). В практическом здравоохранении к эффективным методам ретроспективной серологической диагностики относятся: РИГА с эритроцитарным кишечноиерсиниозным 03 и 09 антигенными диагностикумами и ИФА. Положительным результатом серологического исследования парных сывороток крови в РИГА считается положительная или отрицательная «четырех - и более кратная» сероконверсия антител против Yersinia enterocolitica 03 и 09. Разработанная отечественная тест-система (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург) на основе белка наружной мембраны иерсиний для ИФА, обеспечивает обнаружение специфических IgM, IgA.n IgG.

КАМПИЛОБАКТЕРИОЗ. Возбудитель - кампилобактеры, строгие анаэробы, грамотрицательные, слегка изогнутые палочки из семейства Campylobacteriaceae. Этиологическое значение в развитии кишечной формы кампилобактериоза имеют C.jejuni, С. coli и C.lari. С.fetus нередко являются возбудителями артритов, менингитов, менингоэнцефалитов, абортов, эндокардитов, тромбофлебитов и васкулитов, C.sputorum

- расцениваются как комменсалы полости рта, способных вызвать болезни периодонта, С. concisus - диареи и кожные поражения. Виды C.cinaedi и С. hyointestinalisupsaliensis региструются в кишечнике при иммунодефицитных состояниях и играют роль в патогенезе проктитов. Лабораторная диагностика играет ведущую роль в постановке этиологического диагноза кампилобактериоза. основанного на результатах микроскопии мазков нативного материала, бактериологический для выделения чистой культуры возбудителя, экспресс- методы выявления антигенов возбудителя ₀ и методы ретроспективной серологической диагностики для выявления специфических антител к кампилобактерам в сыворотке крови. Материалом для исследования кишечной формы служат фекалии. Для внекишечных клинических форм используют пробы крови, ликвора, гноя из абсцессов, синовиальной жидкости, желчи и околоплодных вод. Для быстрой и ориентировочной диагностики кампилобактериоза проводят микроскопический метод исследования, позволяющий регистрировать грамотрицательные, извитые палочки. Однако этот метод дает достоверные результаты только при обсемененности исследуемого материала, пропорциональной 10⁵ КОЕ\мл. Выделение чистой культуры возбудителя из фекалий является основным методом лабораторной диагностики. При необходимости транспортировки исследуемого материала применяют транспортные среды: тиогликолевая среда для контроля стерильности, среда Керри-Блэр и др. Посев проб фекалия производят на специальные среды для выделения кампилобактеров (ЖЭКА

- железо-эритрит-кровяной агар, селективный эритрит-агар, кампилобакагар, МППА - мясопептонно-печеночный агар), инкубирование посевов - в микроаэрофильных условиях при 42°С. Классический бактериологический метод исследования является дорогим и трудоемким, так как кампилобактеры - микроаэрофильные (техника выделения приближается к таковой для анаэробов) и трудно культивируемые микроорганизмы, диагностики кампилобактериоза Высокой чувствительностью отличаются экспресс- методы: ПЦР (индикация специфической ДНК), ИФА (выявление антигенов в биоматериале) и РСК (обнаружение антигенов в сыворотке крови) и методы серологической ретроспективной диагностики для выявления антител в парных сыворотках крови в динамике заболевания в РПГА с антигенным диагностикумом и в РСК.

ХОЛЕРА. Возбудитель холеры - холерный вибрион (Vibrio cholerae), представлен двумя основными биоварами: Vibrio cholerae 01 биовар cholerae (классический) и Vibrio cholerae 01 биовар eltor. Вибрионы Vibrio cholerae 0139 bengal обладают способностью выделять идентичный ранее известным биоварам (Vibrio cholerae 01 биовар cholerae и Vibrio cholerae 01 биовар eltor) холерных вибрионов экзотоксин и вызывать сходное по клинике заболевание, так называемую холеру Бенгал. Основным методом диагностики является бактериологический метод (выделение чистой культуры возбудителя). Материалом для бактериологического исследования служат испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал (отрезки тонкого кишечника и желчный пузырь), предметы из окружения больного в очаге (белье, посуда), объекты окружающей среды (вода, ил, стоки, гидробионты), пищевые продукты и т.д. Исследуемый материал следует доставлять в лабораторию не позже 2 ч после забора (так как возбудитель быстро погибает, особенно в испражнениях). При невозможности срочной доставки образцы помещают в 1% пептонную воду с рН 8, 2-8, 6. При наличии у больного диареи и рвоты испражнения и рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в чистую посуду (ложками ли стеклянными трубками с резиновой грушей) и направляют в лабораторию в нативном виде (в стеклянных банках с притертой пробкой, либо в контейнерах с крышкой) или в 1 % пептонной воде, в которую вносят 2-3 мл испражнений. Материал от больных без диареи, реконвалесцентов и лиц, обследуемых на вибрионосительство, забирают ватными тампонами или алюмининиевыми петлями и помещают в 5-10 мл транспортной среды. Желчь берут при дуоденальном зондировании в отдельные пробирки (порцию из желчного пузыря и порцию из желчных протоков). Для выделения холерных вибрионов используют питательные среды: 1% пептонную воду (рН 8, 2-8, 6), щелочной агар, TCBS и СЭДХ. От умерших с подозрением на холеру исследуют отрезки верхней, средней и нижней частей тонкого кишечника длиной около 10 см. Желчный пузырь после перевязки протока извлекается полностью. Рост проб секционного материала изучают на первой среде накопления (1% пептопная вода, рН 8, 2-8, 6) и выполняют высев на щелочной агар и вторую среду накопления ((1% пептонная вода, рН 8, 2-8, 6), что повышает высеваемость возбудителя. Если на первом этапе при исследовании нативного материала ускоренными методами получают положительные результаты, пересев на вторую среду накопления не проводят. Подозрительные колонии пересевают для выделения чистых культур, затем определяют морфологические, биохимические свойства и антигенную структуру холеры с помощью агглютинирующих О-, OR-, Инаба- и Огава-антисывороток. Важное диагностическое значение имеет типирование с помощью холерных диагностических бактериофагов. Все V. cholerae лизируются бактериофагом IV группы, а вибрионы биовара Эль-Тор — фагами группы V. Для ускоренной диагностики холеры применяют иммунолюминесцептный, иммобилизационный методы и РАГА с диагностикумом. Нецелесообразно проводить бактериоскопию мазков и препаратов методом «висячей капли» из нативного материала. Для ускоренной биохимической идентификации возбудителя холеры предложен набор СИБ из 13 тестов (оксида-за, индол, лактоза, глюкоза, сахароза, манноза, арабиноза, маннит, инозит, аргинин, орнитин, лизин), дифференцирующий от представителей семейства Enterobacteriaceae, бактерий родов Plesiomonas, Aeromunas и др. При выделении Vibrio cholerae группы, отличной от 01, возбудитель необходимо тигшровать с помощью других антисывороток. При выделении таких бактерий от больного с диареей обязательным считают проведение всего объёма исследований для диагностики холеры. Определение AT в крови больных холерой носит вспомогательный характер. Их выявляют в РА, а также путём обнаружения вибриоцидных AT и антитоксинов.